大山樱叶绿体基因组特征及密码子偏好性分析

为了明确大山樱叶绿体基因组特征及其密码子使用偏好,共筛选53条叶绿体CDS基因序列作为分析对象。使用CodonW 1.4.4等软件对大山樱密码子使用偏好性进行分析。结果表明,大山樱叶绿体基因组GC₃含量为28.84%,含量较低;RECU>1的30个密码子中,有29个以A/U结尾;ENC平均值为47.54,证明其密码子偏好性较弱。3种绘图分析结果均表明自然选择对密码子偏好性影响较大。最终确定10个最优密码子,且7个以A/U结尾。基于CDS序列和RSCU值的系统发育分析及聚类分析结果相似,表明密码子偏好性和物种系统发育关系有一定关联。该结果为研究樱亚属植物叶绿体基因组特征及其密码子偏好性提供了相关依据。     

奇异双身虫线粒体基因组测定及其密码子偏好性分析

【目的】为确定奇异双身虫线粒体基因组基本结构特征并探究奇异双身虫分类地位,同时了解双身虫科物种的密码子偏好性。【方法】采用二代高通量测序技术获得奇异双身虫线粒体基因组序列,通过MITOS在线网页对线粒体基因组序列进行注释并通过PhyloSuite (version1.2.2)软件对其结构进行分析,同时对奇异双身虫及其他8种双身虫科物种的线粒体蛋白质编码基因的密码子组成情况及密码子偏好性进行分析。【结果】奇异双身虫的线粒体基因组序列长度为15 713 bp(大非编码区未测全),A+T含量为68.7%,表现出明显的AT偏向。系统发育树结果显示,基于现有数据双身虫科物种聚为一支,支持双身虫科物种的单系性。对双身虫科物种的密码子使用偏好进行分析,结果指出双身虫科有效密码子数(ENC)范围为30.632-37.495;相对同义密码子使用值(RSCU)>1的密码子共有18个,偏好以碱基U(T)结尾。PR2-plot分析结果显示T的使用频率高于A,G的使用频率高于C,突变和选择等因素均可对密码子的使用偏好产生一定的影响。中性绘图分析显示奇异双身虫和马口鱼拟双身虫受突变压力的影响分别为61.89%和51.31%,其余7种双身虫均受突变压力的影响小于50%。【结论】双身虫科密码子偏好性存在略微差异,但都受突变压力、自然选择和碱基组成的共同影响。【意义】本研究可以为后续的系统进化研究提供重要依据。     

5种冰草叶绿体基因组密码子偏好性分析

本研究从5种冰草叶绿体基因组中各筛选出52条蛋白编码序列,利用CodonW、SPSS、EXCEL等软件对其进行密码子偏好性使用模式分析。结果显示,在RSCU分析结果中,共有31个高频密码子,有28个是以A/U结尾,密码子偏好性在冰草叶绿体基因组中的表现较弱。中性分析结果显示,自然选择在冰草叶绿体基因组密码子偏好性发挥作用;在有效密码子数的结果中,偏好性多受突变影响;PR2-plot分析结果,大部分基因由选择调控。此外筛选出8个高频高表达的最优密码子,分别为CGA、UUG、UCA、GAU、UUU、UCC、GGA、ACA。冰草叶绿体基因组密码子偏好性种间差异不显著,且根据中性分析、ENC-plot、PR2-plot分析密码子偏好性可能受多种因素共同作用。最优密码子的选择,为冰草叶绿体基因组工程中外源性基因表达效率的提高奠定基础。     

霸王密码子偏好性分析

为了解霸王密码子使用特征及形成原因,本研究以NCBI网站中霸王的EST数据为材料,从中选取637条高质量基因为研究对象,利用Codon W、Excel等软件分析密码子使用特征。结果表明：霸王密码子的平均ENC为51.594,平均CAI为0.179,平均GC_3s为41.14%,密码子使用偏好性较弱,密码子第3位偏好使用以A/T结尾的碱基;ENC绘图分析、中性分析、偏倚分析结果说明自然选择是引起霸王密码子偏好使用的主要因素,但同时还受突变压力和其他因素的影响;偏倚分析中,大部分基因都分布在中心点的左下方,说明密码子第3位上A的使用频率小于T的使用频率,G的使用频率小于C的使用频率。以ENC值和RSCU值为参考标准,确定了28个高频密码子(RSCU>1),以A/U结尾的占82.14%;确定了27个高表达密码子(△RSCU≥0.08),最终筛选出UAU、UGU、UGA、CAU、AGC、GUG为最优密码子。本研究为霸王密码子优化以及基因工程中外源基因的改良和表达提供理论依据。     

大麦黄矮病毒的生物信息学分析

[目的]分析大麦黄矮病毒(BYDV)株系的生物学信息,为深入研究BYDV各株系的遗传特性及防治提供参考.[方法]从NCBI数据库搜索BYDV的全基因组序列,利用DNASTAR 7.1对其进行序列比对分析,并以MEGA 7.0构建BYDV系统发育进化树.用CodonW分析BYDV的密码子使用偏好性;运用NCBI中的E-Utilities工具搜索BYDV各株系的基因及蛋白,采用SWISS-MODEL预测BYDV蛋白的三级结构.[结果]BYDV各株系碱基序列相似性存在明显差异,其中PAV株系组内核苷酸序列最低相似性最低,仅为77.9%,表明该株系全基因组序列变异较多.PAV、Ker-II、GAV和RPV株系存在碱基突变,均以C—T碱基突变数目最多,且碱基变异倾向于碱基转换.BYDV各株系分为五大分支,其中分离地相近的株系或同一株系BYDV间亲缘关系较近,来自法国克尔格伦群岛的Ker-II株系与PAV株系亲缘关系较近,来自美国的MAV株系与来自我国的GAV株系亲缘关系较近,来自我国的GPV株系(NC-012931)与美国的RPV、RMV和RPS株系亲缘关系较近.BYDV密码子使用无明显的偏好性.PAS、MAV和GAV株系的基因组中均包含7个基因,而PAV株系基因组包含8个基因.在BYDV各株系gp1~gp4蛋白中,gp4蛋白的三级结构保守性最强,而gp1蛋白的空间结构发生一定变异,正是不同BYDV株系的传播媒介及对寄主植物侵染能力存在差异的原因.[结论]BYDV各株系普遍发生分子变异,但变异程度不同,以PAV株系变异程度最大;推测GPV和RMV株系隶属于马铃薯卷叶病毒属.     

美味猕猴桃过氧化物酶基因 AdPOD27 的密码子偏好特征分析

为了解美味猕猴桃过氧化物酶基因 AdPOD27 的密码子偏好特征,本研究采用 CodonW1.4.2、SPSS19.0、MEGA5.2 和 EMBOSS 等软件分析 AdPOD27 的密码子偏好性参数,同时对单子叶植物和双子叶植物间 POD27 的密码子使用规律进行比较。结果表明,AdPOD27 有效密码子数（ENc）、密码子 G 和 C 含量（GC）、密码子第 3 位 G 或 C 的含量（GC3s）分别50.65、0.443 和 0.429,意示着 AdPOD27 密码子偏好性较弱但偏好使用含有较多 A 和 T 并以 A 或 T 结尾的密码子;单子叶植物和双子叶植物平均 ENc 值分别为 36.93 和 52.25,单子叶植物 POD27密码子偏好性普遍强于双子叶植物;聚类分析结果表明,物种间具有严格的密码子偏好性规律。此外,AdPOD27与猕猴桃基因组密码子使用频率存在一定差异。本研究结果为进一步开展 AdPOD27 基因功能和分子进化研究提供了科学依据。     

13种植物actin基因的密码子使用特性分析

[目的]分析13种植物actin基因的密码子组成、密码子偏性及聚类关系,了解其密码子使用模式及影响密码子使用的因素,为深入研究分子进化及物种进化提供参考.[方法]运用CodonW 1.4.4软件分析13种植物的肌动蛋白基因(actin)密码子组成及使用参数,并对影响密码子偏性的因素进行研究.应用MEGA 4.1对13条基因的CDS序列进行聚类分析,采用SPSS 20.0进行密码子偏性的聚类分析.[结果]双子叶植物中actin基因的GC含量为45.0%~51.2%、GC3s含量为36.3%~53.8%,单子叶植物中GC含量为53.0%~58.3%、GC3s含量为60.9%~75.8%;actin基因在单子叶植物中偏爱G/C结尾的密码子,双子叶植物中偏爱A/T结尾的密码子.GC和GC3s与有效密码子数(ENC)呈极显著负相关(P<0.01),相关系数均为-0.906.ENC绘图分析结果表明,actin基因密码子偏性同时受突变和选择压力影响,单子叶植物受选择压力影响的程度大于双子叶植物.基于actin基因密码子偏性的聚类将单子叶植物高粱、玉米聚为一类,水稻、大麦、竹聚为一类,8种双子叶植物聚为一类.[结论]actin基因密码子偏性与碱基组成密切相关,其密码子偏性在单、双子叶植物间存在差异,依据密码子偏性的聚类能在一定程度上反映物种间的亲缘关系.     

绵羊肺炎支原体hlyA基因的表达及活性初步鉴定

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)可引起绵羊(Ovis aries)及山羊(Capra hircus)的支原体性肺炎,分布广泛,危害严重.本实验在课题组前期完成MO Y98株基因组测序的基础上,通过基因注释、PCR等获得了该菌株可能的溶血素(hemolysin,hlyA)基因;依据大肠杆菌(Escherichia coli)优势密码子对hlyA基因进行优化,构建优化后hlyA原核表达质粒pET32a-hlyA;将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,获得了相应的重组菌株,并对重组菌株进行诱导表达;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定,并经Ni2+金属螯合柱纯化.克隆了MO hlyA基因序列(GenBank登录号:KT598390),片段大小为375 bp,编码125个氨基酸.优化后密码子适应指数为0.91,目的基因适于在大肠杆菌中表达.重组融合蛋白多以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为31.6 kD,与预期大小一致.Western blot结果显示,上清中纯化出的目的蛋白能与一抗发生反应,重组蛋白特异性较好.溶血实验表明,当纯化后蛋白浓度稀释到0.125 μg/mL时,溶解红细胞的能力已经下降.该研究结果为后续绵羊肺炎支原体致病性研究提供了基础资料.     

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。     

蒺藜苜蓿叶绿体密码子偏好性分析

本文对蒺藜苜蓿叶绿体基因组全序列密码子进行分析,筛选出50条CDS(coding DNA sequence)利用CodonW软件进行分析其密码子使用模式。结果显示,蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子第3位碱基GC含量为26.9%,即第3位密码子富含A和U,ENC值在37.11~51.91之间密码子偏好性较弱。相对同义密码子使用度分析显示RSCU值大于1的密码子有23个,其中以A和U为结尾20个。中性绘图分析显示GC₁₂与GC₃的相关系数为0.341,相关性不显著,回归系数为0.4843;单基因ENC比值多分布在-0.05~0.05,即大部分基因ENC值离ENC期望值较近;对应性分析,第一轴显示了12.50%的差异为主要影响因素,第一轴与ENC和GC₃的相关系数分别为0.091和-0.092,均相关不显著。综合这几项分析发现蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子偏好性主要受到突变的影响,但是并不是唯一的影响因素,其他因素对密码子偏好性也可能有一定的影响。最终通过高表达优越密码子方法确定得出UUA、UUG、CCU等23个密码子为最优密码子,为之后对外源基因进行改造,提高其在叶绿体中的表达效率奠定了基础。