中内毒素（LPS）诱导后家蝇幼虫抗菌肽CecMd基因的克隆、生物信息学分析及其表达载体的构建

从脂多糖（LPS）诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇Cecropin基因（GenBank：DQ 232774）设计特异性引物,应用RT—PCR技术扩增出编码CecMd开放阅读框（ORF）的eDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将CecMd亚克隆基因与线性化的pET32a（＋）连接,构建重组表达载体pET32a（＋）／CecMid,并对此基因及其推导氨基酸序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从脂多糖（LPS）诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽Cecropin基因,命名为CecMd,但是从未诱导的虫体内未能获得此基因;CecMd开放阅读框的cDNA全长为192bp,编码由63个氨基酸残基组成的多肽;此多肽最可能的裂解位点在氨基酸残基A23和G24之间,提示1～23氨基酸残基组成信号肽,24～63氨基酸残基构成成熟肽;CecMd的全长肽包含4个螺旋,成熟肽（不包括信号肽）含有2个螺旋,两者均不合二硫键;CecMd与果蝇Cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81．0％以上;经PCR,限制酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建了重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md 。重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md的构建及其CecMd基因的生物信息学分析对其生物学功能研究和高效表达工程菌的构建具有重要意义。     

Inheritance and Molecular Marker of Resistance to Bot Canker in Malus domestica

Apple bot canker[Botryosphaeria dothidea(Moug.)Ces.et de Not.]is distributed worldwide,resulting in a serious crop loss every year in apple(Malus domestica Borkh.)production.The resistance of each seedling derived from a hybrid population(Jonathan×Golden Delicious)was evaluated by disease index either from natural infection in the field or from inoculation with five isolates of B.dothidea,Ls1,Lw023,Lw048,Mx1,and Zz26.The inheritance of the resistance to bot canker was analyzed via frequency distribution analysis,and microsatellite and AFLP markers linked to the resistance loci were screened.From the binary frequency distribution patterns,it was found that the segregation ratio of resistant/susceptible genotypes infected by pathogen isolates Lw023 and Ls1 was 1:15:and that by Zz26 and Mx1 was 15:1.The variation of resistance was involved in the segregation of two to four alleles of major genes,the resistance was recessive when infected by Lw023 and Ls1.but was dominant when infected with Mx1 and Zz26.A microsatellite maker,CH02a04-450,and two AFLP markers,E-AG/M-GAC-280 and E-AGG/M-CTT-110,were identified,and their map distances to the resistance loci were 5.1,5.1 and 6.2 cM,respectively.The three markers are located in different linkage groups,while CH02a04-450 is on linkage group 2 or 7.E-AG/M-GAC-280 was successfully converted into SCAR 159.Finally.CH02a04-450 and SCAR159 were re-examined in inoculated segregation population and presented a good reliability on predicting phenotypes of resistance.     

家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建

运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。     

基于RNAi的家蝇β-葡萄糖苷酶功能分析

【目的】探明家蝇β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BG)在家蝇体内的功能,为深入研究家蝇BG在木质纤维素降解中的作用奠定基础。【方法】针对家蝇BG基因的功能结构域设计3对特异性引物用于dsRNA的体外合成,通过显微注射的方法将dsRNA导入家蝇2龄幼虫,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测抑制效率,分别以滤纸、水杨苷、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠为底物检测BG基因的干扰对家蝇消化道粗酶液滤纸酶活性、BG、CBH(Cellobiohydrolase)及EG(Endoglucanase)酶活性的影响。【结果】在注射dsRNA后18 h家蝇幼虫消化道中BG基因的表达量下降62%且此时为最佳干扰时间点,在BG基因表达受到抑制后家蝇消化道的滤纸酶、BG酶活性显著降低,且时间变化趋势与上述干扰条件下BG基因表达量变化一致,均在干扰后18 h酶活性达最低,但CBH及EG酶活性较对照组无显著变化。【结论】RNA干扰技术能够有效抑制家蝇BG基因的表达,推测家蝇BG具有滤纸酶和BG酶活性。     

家蝇血细胞的扫描电镜观察

运用扫描电镜观察了家蝇的血细胞,发现家蝇的血细胞主要有原血胞,浆血胞,珠（粒）血胞以及类绛（囊）血胞４种类型;不存在典型的珠血胞与粒血胞,只是另有一类血胞兼具二者的特点;家蝇的浆血胞具有极强的吞噬能力,类绛（囊）血胞也可能与其免疫作用有关。     

家蝇血淋巴凝集素诱导动力学的研究

用生物的、生理的诱导因子,均能诱导家蝇的血淋巴提高凝血活力,实验确定了各诱导因子的最佳诱导剂量,同时,各诱导因子的诱导效果存在差异;在这些诱导因子中,以刺伤诱导的效果最好;Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２诱导时,是通过刺伤体壁感染家蝇的,但其诱导效果反而低于单纯的刺伤诱导。同时诱导方法对不同的虫态,结果也有所差异,低龄幼虫即使经地诱导,血淋巴中也不具有凝血活性,在末龄幼虫,蛹以及成虫这３种虫态中,蛹的血淋巴凝     

人胰岛素基因在家蝇幼虫中的表达

构建了家蝇基因组文库,通过噬菌斑原位杂交技术从家蝇基因组文库中筛选出mdYP1克隆,并从mdYP1克隆中分离到含约1.7 kb 5’-上游区的家蝇卵黄蛋白-1基因组基因序列.PCR扩增出大小不同的4个启动子片段,分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游,构建pMYP1-GFP,pMYP2-GFP,pMYP3-GFP和pMYP4-GFP 4个重组质粒,经电转移试验和荧光检测表明,P2( 684/ 7),P3( 1165/ 7)和P4( 1616/ 7)3个启动子片段具有转录活性.将P2,P3分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-ImINS重组质粒中的人胰岛素基因上游,构建pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS重组质粒,电转移新鲜家蝇卵,放射免疫分析法检测人胰岛素在蝇蛆中的表达水平.pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS组的人胰岛素表达量分别为29.6,22.1mU.L-1;阳性对照组为13.2 mU.L-1;阴性对照组为8.8 mU.L-1.结果说明P2启动子片段活性最强,同时又证明了内源性启动子能提高外源基因的表达效率.     

家蝇基因组文库的构建

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。重组噬菌体转染 KW2 51 宿主菌 ,测定文库效价为 5× 10 4 pfu/m L     

巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响

以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,利用琼脂糖孔穴扩散法,检测了巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响.结果显示,巯基乙醇本身对3种指示菌具有抑菌活性,其非抑菌浓度为至少稀释10<'6>倍;当巯基乙醇稀释106倍时,可有效保护不高于1:5浓度的家蝇幼虫血淋巴悬液不被氧化,且与对照相比不影响血淋巴的抑菌活性;当巯基乙醇稀释少于10<'6>时,血淋巴的抑菌活性明显增大.     

辛硫磷对氰戊菊酯在抗性家蝇体内的增效机制

作者就辛硫磷对氰戊菊酯在抗拟除虫菊酯类杀虫剂的家蝇体内的增效作用进行了初步的研究。结果表明：在辛硫磷与氰戊菊酯同时存在时（质量比为２：１），家蝇体内未被降解的氰戊菊酯原化合物含量显著高于只使用等剂量氰戊菊酯时的对照处理（２．６－４．６倍）。同时，家蝇对氰戊菊酯的氧化代射速率降低（１７－４８％）。这些结果可能是辛硫磷对氰戊菊酯增效的主要作用机制，并对延缓害虫抗药性发展有积极的作用。