人雌激素受体cDNA在酵母细胞中的表达

根据人全长雌激素受体cDNA序列,用RT—PCR方法使乳腺癌细胞MCF-7株扩增人雌激素受体基因(hER cDNA),通过pGEM—T／hER载体克隆到酵母表达载体中,并转化到酿酒酵母细胞中,用Western blot法和免疫组化法检测hER cDNA的表达。结果表明：hER cDNA在酵母细胞中成功表达,可用于建立环境雌激素的酵母细胞检测体系。     

快速筛选环境雌激素酵母细胞的试验研究

通过分子生物学技术将雌激素效应元件(ERE)基本序列插入β-半乳糖苷酶的Lac Z报告基因的上游．并将其置于重组酵母细胞雌激素受体(ER)的调控之下。结果表明：当环境雌激素作用于酵母细胞时,会使ER发生变构效应．与ERE结合使LacZ基因得以表达．其表达量与环境雌激素的污染程度具有剂量效应关系,通过检测β-半乳糖苷酶的活性,可反映环境雌激素的污染程度;与双酚A和苯甲酸雌二醇活性相比较,β-雌二醇活性最强,但双酚A活性明显高于苯甲酸雌二醇。     

中国美利奴成母羊促甲状腺激素受体基因的克隆与组织表达

[目的]探讨绵羊TSHR基因序列及组织表达特征,为进一步研究TSHR在绵羊季节性繁殖中作用的分子机理奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术克隆绵羊TSHR基因,并对序列进行生物信息学分析;采用半定量RT-PCR技术检测TSHR在绵羊不同组织的表达情况.[结果]以中国美利奴羊卵巢组织cDNA为模板,获得了3 276 bp的TSHR cDNA序列,包括全部编码区序列(Coding Sequence,CDS)长2 295 bp,编码764个氨基酸.TSHR蛋白结构经预测发现存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点.半定量RT-PCR结果显示,绵羊TSHR基因在所检测组织中均有表达,其中在下丘脑、松果体和垂体中呈高丰度表达,在甲状腺、子宫等组织呈中等丰度表达.[结论]从绵羊卵巢组织中克隆到TSHR基因并进行了序列分析;TSHR基因在绵羊各组织中广谱表达,但在下丘脑、松果体、垂体、甲状腺中表达水平较高,提示TSHR在绵羊季节性繁殖等重要生理活动的神经内分泌调节过程中发挥重要作用.     

大白菜 PHK4基因的功能初探

细胞分裂素参与植物生长和发育的许多生理过程。植物细胞分裂素受体属拟南芥细胞分裂素受体基因AHK4同源的细胞分裂于组氨酸蛋白激酶家族,是植物双组分信号系统的组分。克隆了大白菜的素受体基因PHK4（Pekinensis putative Histidine Kinase 4）,采用反向遗传学的方法对其功能进行分析,初步阐述了大白菜PHK4作为细胞分裂素受体起作用,对研究调控大白菜与细胞分裂素相关的生长发育过程奠定了理论基础。     

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。     

siRNA沉默NCOA2基因对猪肌内前体脂肪细胞分化的影响

[目的]本文旨在研究核受体共激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。[方法]用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测NCOA2在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化;通过NCOA2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制内源NCOA2的表达,并用油红O染色检测沉默NCOA2对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响,通过qRT-PCR检测沉默NCOA2对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和脂联素(adiponectin,ADIPOQ)表达的影响。[结果]NCOA2在肌内前体脂肪细胞分化第4天表达量显著升高(P0.05);降低NCOA2表达可显著抑制肌内前体脂肪细胞分化(P0.05),且PPARγ、FABP4、LPL和ADIPOQ基因的表达也受到显著抑制(P0.05)。[结论]体外siRNA沉默NCOA2基因可抑制猪肌内前体脂肪的分化,这可能与PPARγ、FABP4、LPL、ADIPOQ等基因的低表达有关。     

γ-干扰素受体在山羊颈前神经节的表达

旨在探索山羊颈前神经节是否具备接受γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)作用的条件,是否有IFN-γ受体(interferon-γreceptor,IFNGR)的存在,进而明确神经调节与免疫调节之间的关系。分别取雌雄成年山羊颈前神经节各5对,用免疫组化SP法和PCR方法检测IFNGR在颈前神经节的表达情况。结果表明,在山羊颈前神经节的神经元、卫星细胞和神经纤维均有IFNGR免疫阳性产物分布,但主要分布于神经元胞体,IFNGR在神经元胞体的相对表达量显著高于非神经细胞结构(P0.05)。在山羊颈前神经节扩增到IFNGR1基因的cDNA片段全长376bp,与绵羊、牛、野猪、家兔、褐家鼠IFNGR1基因同源性分别为98%、97%、84%、73%、66%。在山羊颈前神经节中IFNGR主要在交感节后神经元表达与分布,具备对IFN-γ刺激做出反应的条件,提示山羊颈前神经节可能作为IFN-γ对靶器官免疫内分泌调节途径和自主神经对靶器官调节的神经途径之间相互协调的关键点。     

接头分子在TLRs信号传导中的作用研究进展

接头分子在Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式、发动和调节先天与后天免疫反应的信号传导网络中发挥着重要的生物学作用,与Toll样受体相结合后,其下游激酶和转录因子传导信号,激活细胞内核转录因子调控作用元件。TLRs接头分子的共同特征是含有TIR结构域,不同TLRs家族成员可依赖于一个或多个接头分子传导信号。对目前已确认的MyD88、MAL/TIRAP、TRIF、TRAM和SARM 5种接头分子在TLRs信号传导途径中的调控作用进行综述,以期为研究接头分子在TLRs信号传导中的作用机制提供参考。     

赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉酪胺(TA)章鱼胺多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。     

奥尼罗非鱼GHR2基因序列及其表达特征分析

[目的]深入了解生长激素受体2(GHR2)基因在奥尼杂交罗非鱼及其亲本(尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼)中的表达差异,为研究杂交过程中GHR基因的结构及功能变化提供依据,也为鱼类杂交育种提供理论支撑.[方法]利用SOAPdenovo从奥尼罗非鱼肝脏转录组数据中提取GHR2基因序列,采用BioEdit 7.0.5.3比对奥尼罗非鱼及其亲本的GHR2氨基酸序列差异,以MEGA 4.1进行系统进化分析及构建系统发育进化树,并利用实时定量PCR分析GHR2基因在奥尼罗非鱼不同组织中的表达情况及其在奥尼罗非鱼和亲本中的表达差异.[结果]拼接获得的奥尼罗非鱼GHR2基因开放阅读框为1722 bp,共编码574个氨基酸,相对分子量为64.18 kD,理论等电点为4.86;奥尼罗非鱼GHR2氨基酸序列包含一个保守的信号肽和一段跨膜区.基于GHR2氨基酸序列构建的系统发育进化树显示,奥尼罗非鱼与尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼存在高度相近的亲缘关系,尤其与母本(尼罗罗非鱼)的亲缘关系最近.GHR2基因在奥尼罗非鱼不同组织中均有表达,以在肝脏中的表达量最高,显著高于除肌肉外的其他组织(P<0.05),其次是肌肉、卵巢、心脏和垂体,在头肾中的表达最低.GHR2基因在奥尼罗非鱼肝脏和肌肉中的表达量明显高于其双亲(尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼)的表达量.[结论]GHR2基因属于广泛表达基因,在奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼中高度保守;GHR2基因在奥尼罗非鱼中的表达优势与其快速生长的杂种优势有关.