异色瓢虫胁迫对棉铃虫生长发育及压力蛋白基因表达的影响

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历期、雌雄蛾寿命、总寿命)和变态发育(蛹重、化蛹率、羽化失败率、卷翅率)指标;设置长时(1龄幼虫至3日龄成虫)和短时(15 min至6 h)异色瓢虫胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测棉铃虫压力蛋白基因(即热激蛋白基因)Hsp70和Hsp90及热激同源蛋白基因Hsc70在胁迫后的表达水平变化。【结果】在捕食性天敌异色瓢虫的胁迫下,棉铃虫幼虫历期、蛹期、雌雄蛾寿命、总寿命均显著性缩短,蛹重和化蛹率显著性下降,成虫卷翅率显著性升高,而羽化失败率无显著性变化。在不同食源的天敌胁迫下,棉铃虫幼虫历期在异色瓢虫取食蚜虫时最短,蛹历期在瓢虫取食棉铃虫卵时最短,总寿命在瓢虫取食虾卵时最短,而雌雄蛾寿命在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异;棉铃虫成虫卷翅率在瓢虫取食棉铃虫卵时最高,而蛹重、化蛹率、羽化失败率在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异。压力蛋白基因Hsp70和Hsp90在短时胁迫下(Hsp70:30min至3 h;Hsp90:15 min、1.5 h、2 h、6 h)表达水平显著性上调,热激同源蛋白基因Hsc70在长时胁迫下(5龄幼虫、预蛹、雄蛹、雌蛾阶段)表达水平显著性上调。【结论】在面对捕食性天敌异色瓢虫长时胁迫作用下,棉铃虫各生长发育阶段均出现缩短的现象,即棉铃虫为躲避被捕食风险表现出了发育加速的现象,而快速的生长发育在一定程度上干扰了变态发育,导致蛹重和化蛹率下降,成虫卷翅率提高,符合权衡效应。棉铃虫对不同食源的天敌胁迫具有不同程度的敏感性,即棉铃虫对潜在的捕食风险可能存在一定的分级能力,但这种分级能力没有得到规律性体现。异色瓢虫胁迫能够引起棉铃虫分子层面的生理反应,导致压力蛋白基因的表达上调,其中压力蛋白基因Hsp70和Hsp90受到短时胁迫的反应较为明显,而热激同源蛋白基因Hsc70受到慢性胁迫刺激的反应更为显著。     

鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表达与纯化

琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析,发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因,将该基因构建到p ET-28a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。经过SDS-PAGE电泳,结果表明:all3556蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达。利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的all3556蛋白,蛋白收率约为27 mg/g菌体。研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。     

拟南芥Mg2+转运蛋白AtMGT10的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】在大肠杆菌系统中原核表达拟南芥叶绿体Mg~(2+)转运蛋白AtMGT10,通过免疫健康成年家兔,获得针对AtMGT10蛋白的多克隆抗体,为研究AtMGT10蛋白在植物生长发育中的功能奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆AtMGT10基因编码区187~786bp的cDNA片段,连接到pET-28a中构建原核表达载体pET-28aAtMGT10~(63-262),转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带有His标签的His-AtMGT10~(63-262)截短重组蛋白。用镍柱亲和纯化后的重组蛋白作为抗原皮下注射免疫家兔,制备针对AtMGT10蛋白的多抗血清。提取拟南芥野生型叶片总蛋白,用AtMGT10多抗血清进行蛋白免疫印迹检测。【结果】经PCR扩增获得了600bp的AtMGT10基因cDNA片段,成功构建原核表达载体pET-28a-AtMGT10~(63-262),在大肠杆菌系统中表达出His-AtMGT10~(63-262)蛋白,经亲和纯化后免疫家兔获得了Anti-AtMGT10多抗血清。在拟南芥野生型总蛋白中用Anti-AtMGT10经免疫印迹检测到大约50ku的蛋白条带,利用抗原竞争试验进一步证明检测到的信号就是拟南芥内源AtMGT10蛋白。【结论】原核表达了His-AtMGT1063-262蛋白,成功制备了特异性较强的AtMGT10蛋白多克隆抗体。     

不同蛋白水平下添加抗菌肽对赤点石斑鱼影响的研究

评估了不同饲料蛋白水平(44%,48%,52%)和抗菌肽浓度(0.01%,0.02%)对赤点石斑鱼生长性能、血清生化、消化酶和抗氧化能力的影响。实验组分别为:D1(44%,0.01%),D2(48%,0.01%),D3(52%,0.01%),D4(44%,0.02%),D5(48%,0.02%),D6(52%,0.02%)。每组3个平行,养殖8周结果如下:一定范围内,增重率、特定生长率和饲料转化率随蛋白水平和抗菌肽浓度增加,D5组显著高于D1组(P0.05)。形态学指标,D6组肝体比(HSI)、脏体比(VSI)和肠系膜脂肪(IPF)显著低于D5组(P0.05)。同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度可降低肌肉粗脂肪含量,D4组显著低于D1组(P0.05)。血清总蛋白、白蛋白含量随蛋白水平和抗菌肽浓度的增加而升高(P0.05),D3和D5组谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血糖显著低于其他组(P0.05)。D5组胰蛋白酶高于其他组(P0.05),D1组过氧化物酶显著低于其他组(P0.05)。随着抗菌肽浓度增加,胃蛋白酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性增加,且丙二醛含量降低(P0.05)。实验结果表明,48%蛋白水平下添加0.02%抗菌肽可以提高赤点石斑鱼生长性能,增强消化酶活性和抗氧化能力,降低饲料系数。     

烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element,HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element,LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。     

小体鲟卵透明带家族ZP3亚型和ZPAX基因cDNAs克隆及其组织表达分析

为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。     

红花油体蛋白基因CtOleosin的克隆及表达

【目的】克隆红花油体蛋白基因CtOleosin,研究其表达特性,为探索其功能奠定基础。【方法】以红花种子为研究对象,于开花后4,8,12,16,20,24,28,32d,提取红花种子总RNA,利用RT-PCR技术克隆红花CtOleosin全长cDNA片段,生物信息学方法分析其特性及结构功能;利用Protparam在线工具分析CtOleosin蛋白的理化性质,用Blastp比对该蛋白与其他物种相关蛋白的同源性,使用SMART软件进行功能区分析;利用荧光定量方法检测该基因在种子不同发育时期的表达量。【结果】克隆了红花CtOleosin基因,其全长639bp,编码213个氨基酸,蛋白理论分子质量约为21.48ku,理论等电点9.39,带正电荷残基18个,负电荷残基14个;红花CtOleosin基因编码产物与向日葵Oleosin的同源性高达59.11%,属于油体蛋白家族成员,此蛋白不存在信号肽,无糖基化位点,存在2个跨膜区;以EF1α作为内参基因分析发现,CtOleosin基因表达量在红花种子发育初期逐渐升高,28d时达到最高,之后又有所下降。【结论】成功克隆了红花CtOleosin基因,明了了其特性、功能、编码产物的基本理化性质,以及其在红花种子不同发育时期的表达量变化情况。     

不同繁殖状态下绵羊繁殖相关组织中CHGA基因的表达分析

为探究绵羊繁殖相关组织中CHGA基因在不同繁殖状态下的表达差异,选取不同光照条件下的成年苏尼特母羊（季节性发情品种）及不同繁殖时期的小尾寒羊母羊（常年发情品种）的下丘脑等10种组织,利用qPCR技术分析不同繁殖状态下各组织中CHGA基因的相对表达量。结果表明,CHGA基因在2个绵羊品种的不同组织中广泛表达且脑部组织中该基因的表达量高于其他组织;不同光照条件下苏尼特羊各组织中CHGA表达差异均不显著（P＞0.05）;黄体期小尾寒羊垂体中CHGA表达量显著高于卵泡期（P＜0.05）,子宫体中该基因的表达量极显著高于卵泡期（P＜0.01）。以上结果暗示CHGA基因可能参与小尾寒羊不同繁殖时期垂体和子宫生理变化的调控。     

3种有机溶剂及其混合物对蛋白核小球藻时间毒性的探究

已有研究表明部分污染物的毒性具有时间依赖性。以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为指示生物,透明96孔微板为实验载体,以3种有机溶剂甲醇(Meth)、乙醇(Eth)、二甲基亚砜(DMSO)及其不同体积比的混合物为研究对象,应用时间毒性微板分析法(简称t-MTA)系统测定有机溶剂及其混合物在0、12、24、48、72和96 h对C.pyrenoidosa的毒性效应。结果表明,有机溶剂对C.pyrenoidosa具有明显的时间依赖毒性特征,但不同有机溶剂毒性的大小不同,随时间增长速率不同,毒性大小顺序亦随时间发生变化;有机溶剂混合物也具有明显的时间依赖毒性特征,不同比例有机溶剂混合物在不同暴露时间的毒性差异不明显,但不同比例有机溶剂混合物毒性随时间的变化规律不同,在0~24 h,体积比为1:1、1:2和1:3混合物的毒性缓慢增加,2:1、3:1混合物的毒性迅速增加;在24~48 h,1:1、1:2和1:3混合物的毒性迅速增加,2:1和3:1混合物的毒性增加速率减缓;48~96h内5种比例混合物的毒性增加速率均减缓;有机溶剂混合物对蛋白核小球藻的毒性变化规律受体积比较大的组分影响。     

利用E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白的研究

为通过E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白,本试验利用DNAstar软件确定含有抗原表位的NS1蛋白片段,然后运用PCR方法从含有NS1基因的载体中扩增NS1抗原表位区基因片段,并将该基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成与GST标签融合的NS1抗原表位基因的表达载体pGEX-GST-NS1,将表达载体转化BL21大肠杆菌筛选出工程菌。经IPTG诱导表达NS1融合蛋白,经GST-琼脂糖凝胶磁珠分离纯化,制备出与GST融合的NS1抗原表位蛋白。经SDS-PAGE以及Western blot鉴定,制备的NS1融合蛋白分子量和预期一致,并且可以和抗GST标签抗体进行特异反应,表明NS1抗原蛋白已成功制备,为下一步NS1抗体的研制提供了必要的条件。