一氧化氮介导内毒素所致的外周血淋巴细胞凋亡及阳离子A的保护作用

采用内毒素（ET）所致家兔ET休克模型，分别在相应处理后3、4、8、12h检测血浆中NO含量的动态变化；用荧光显微镜观察外周血淋巴细胞（PBL）的凋亡情况并计算凋亡指数；用琼脂糖凝胶电泳检测PBL凋亡的特征性DNA降解，并观察阳离子A（CA）注射液对上述指标的影响。结果显示，模型组中各时间段的血浆中NO含量均显著高于对照组（P〈0．01），随着NO含量的增加，PBL凋亡指数明显上升（P〈0．01），其基因组DNA在处理后3、4、8h均发生180-200bp及其整数倍的“阶梯状”断裂，12h出现“弥散状”条带；CA保护组中NO水平和PBL凋亡指数均出现不同程度的降低（P〈0．01，P〈0．05），并且在电泳结果中无明显的“梯状”条带。提示ET可使血液中NO含量升高。NO参与了ET休克的发病机制，介导PBL凋亡，在晚期介导PBL坏死；而CA可有效地中和血液循环中的ET，明显降低机体内NO的含量，抑制PBL凋亡和坏死，对ET休克有一定的保护作用。     

富硒女贞子对山羊外周血淋巴细胞因子及抗氧化活性的影响

建立Con A刺激山羊外周血淋巴细胞增殖模型,采用酶联免疫方法和黄嘌呤氧化酶法测定富硒女贞子作用后淋巴细胞培养上清中细胞因子的浓度和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。分析富硒女贞子对山羊外周血淋巴细胞因子分泌、SOD的影响,探讨富硒女贞子免疫调节机制及抗氧化作用。结果:富硒女贞子蛋白质、齐墩果酸,普通女贞子多糖可明显刺激淋巴细胞产生IL-2,但与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。富硒和普通女贞子均极显著提高外周血淋巴细胞中SOD的活性(P0.01),且富硒女贞子的作用效果明显优于普通女贞子。研究结果表明,富硒女贞子可促进山羊外周血淋巴细胞IL-2的分泌,可提高其抗氧化能力。     

旋毛虫重组二肽基肽酶1在体外对大鼠外周血单个核细胞增殖、吞噬、凋亡等的影响

本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL^-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。     

巨型艾美耳球虫抗原Em8对鸡外周血单核细胞功能的影响

探讨了巨型艾美耳球虫抗原Em8体外对鸡外周血单核细胞(PBMCs)功能的影响。选取抗原基因Em TFP250中具有较好免疫保护性的Em8基因片段,并对其进行原核表达纯化出重组蛋白。无菌采集未被鸡球虫感染的鸡的外周血,分离出单核细胞,加入终浓度为5μg/m L的Em8重组蛋白进行体外培养,通过免疫荧光抗体技术观察重组蛋白与单核细胞的结合情况;Em8重组蛋白不同浓度体外刺激鸡外周血单核细胞,用q PCR技术测定各实验组单核细胞中IL-4、IL-17D、IFN-γ、TGF-β4的mRNA转录水平;采用CCK-8法测定细胞的增殖情况;Em8重组蛋白不同浓度(低、中、高浓度)体外与巨噬细胞共培养,测定巨噬细胞吞噬和NO分泌功能。结果表明:重组蛋白Em8是巨型艾美耳球虫的重要抗原,发挥广泛而重要的免疫作用。其中,重组蛋白Em8能够与外周血单核细胞结合并能刺激细胞因子IL-17D和IFN-γ的表达水平显著提高(P0.01),能够引起单核细胞增值(P0.01),巨噬细胞吞噬作用增强(P0.01)且NO分泌增加(P0.01)。     

中药超微粉对断奶仔猪外周血淋巴细胞免疫功能的影响

目前,饲料添加剂的研究和开发虽已取得了一定的进展,且在提高畜禽生产性能和疾病控制等方面取得了一定的效果,但随着对中草药饲料添加剂研究的深入,发现仍然存在着一些问题[1],如:科技含量低,传统应用多为草药直接粉碎,添加量大,作用效果不稳定;单胃动物对粗纤维的消化能力有限,而中草药多为植物的茎、根、皮,粗纤维含量很高,有效成分包含于植物中,而细胞壁也多为粗纤维构成,单胃动物多不能破坏细胞壁,有效成分就不能很好的发挥,因此产品科技含量不高制约着它向更高层次的发展;对中草药饲料添加剂机理的研究大多仍沿用传统的中医理论,并且一般只限于畜禽效果方面的研究,而缺乏判定效果的客观指标,没有深入到中草药添加剂有效成分的作用机理,难以形成普遍认可的产品.     

Cloning of Carp Inducible Nitric Oxide Synthase Full-length cDNA and its Differential Expression Analysis in Peripheral Blood Leukocytes

The study was aimed to obtain carp iNOS cDNA full-length sequence, and investigate the changes in peripheral blood leukocyte expression of iNOS in the stimulation of different mitogens.Based on EST sequences of iNOS that obtained from carp normal peripheral blood leukocytes cDNA library, full-length cDNA sequence of carp iNOS was successfully amplified by using gene library screening and rapid-amplification of cDNA 5'ends (5'-RACE) method.Carp peripheral blood leukocytes were divided into control and experimental groups and cultured.The experimental groups were stimulated by LPS (1.0 μg/mL) and ConA (1.0 μg/mL) for 4 and 12 h, respectively.And control groups were in the same cultured conditon time without mitogen stimulated.Real-time PCR was used to detect the expression of iNOS in peripheral blood leukocytes of each group.The results showed that the cDNA fragment was total 3 704 bp containing 74 bp 5'untranslated region (UTR), 246 bp 3'UTR and a 3 384 bp ORF encoding 1 127 amino acids.Sequence homology analysis showed that the amino acid sequence of carp iNOS shared 100% identity with Carassius auratus.After LPS and ConA stimulation, the iNOS expression of peripheral blood leukocytes in the experimental groups were increased, and the expression in the short time stimulation condition (4 h) was higher than the long time (LPS 12 h; ConA 24 h).In conclusion, iNOS expression of peripheral blood leukocytes was raised after LPS and ConA stimulation, suggesting that there were dynamic changes in the inflammation.     

猪流感病毒毒株感染对猪外周血淋巴细胞炎性因子转录时相的影响

试验用猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）（毒株）体外感染猪外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,利用real—timePCR方法对病毒感染不同时间细胞中的病毒量和炎性细胞因子mRNA表达量进行检测。结果显示,感染后1h就可检测到病毒,但病毒量相对较小;在24h时病毒开始大量增殖;在72h病毒量达到最高峰,为1h时20倍以上。IL-1βmRNA的表达量在48h增加到最高;IL-6mRNA的表达量在感染后1h内显著增加;IL-8mRNA的表达量在12h时达到最大量;IL-12P35mRNA的表达量在72h迅速上升,为对照的56．1倍;IL-12P40mRNA的表达量在1～2h表达量较高;IL-13在72h达到最大值,为对照的30．7倍;IL-17mR—NA的表达量在72h达到最大值,为对照的4．9倍;IL-18mRNA的表达量在12h达到对照的1．9倍。结果表明,SIV感染PBMC后,随着病毒的大量复制,多种炎性细胞因子表达量显著增加。     

硫酸粘杆菌素对獭兔肠道菌群及免疫功能的影响

为探讨硫酸粘杆菌素对獭兔盲肠菌群和免疫器官组织TLR2、TLR4mRNA相对表达量及外周血细胞因子含量的影响,试验分为2组,Ⅰ组(对照组)饲喂基础全价饲料;Ⅱ组饲喂含20mg/kg硫酸粘杆菌素的基础全价饲料。试验期为28d。试验应用PCR-DGGE及Real-Time PCR技术比较分析獭兔盲肠菌群结构的差异,采用ELISA检测外周血中细胞因子的含量,Real-Time PCR检测TLR2、TLR4mRNA相对表达量。结果表明:Ⅱ组盲肠菌群多样性与Ⅰ组相似(P0.05);Ⅱ组盲肠中梭菌类群XIVa、肠球菌属、链球菌属数量明显高于Ⅰ组(P0.05),梭菌类群Ⅳ明显低于Ⅰ组(P0.05);Ⅱ组盲肠TLR2/4和回肠TLR4的相对表达量高于Ⅰ组,盲肠TLR4差异显著(P0.05),其余差异不显著(P0.05)。与Ⅰ组相比,Ⅱ组獭兔脾脏指数和脾脏TLR2/4表达量增加,肝脏指数和肝脏TLR4表达量减少,均无显著差异(P0.05),但肝脏TLR2显著增加(P0.05);Ⅱ组外周血细胞因子IL-4的浓度显著高于Ⅰ组(P0.05)。饲料中添加20mg/kg的硫酸粘杆菌素可在一定程度上促进断奶幼兔脾脏发育并提高机体免疫力。     

4种方法制备外周血淋巴细胞总RNA对鹅α干扰素的影响比较

无菌采取鹅外周血并进行抗凝处理,以全血提取法、细胞分离直接提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离诱导提取法分别提取外周血中淋巴细胞的总RNA;紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率;以总RNA为模板通过RT-PCR法扩增鹅α-干扰素(Go IFN-α)基因,并构建重组质粒p GEMT-α,通过比较Go IFN-α序列确定各种提取方法的可行性。结果显示,4种方法提取的RNA纯度高,均可作为模板扩增出目的基因,满足后续的分子生物学研究;其中以细胞分离直接提取法制备的RNA产量最多,此结论为外周血淋巴细胞总RNA的提取提供了一种更快捷的方法。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)cDNA序列，设计1对引物。应用RT-PCR，分别从经过植物血凝素-P(PHA-P)或刀豆蛋白A(ConA)诱导的猪外周血单核细胞总RNA中扩增得到了猪GM-CSF cDNA，将其与pGEM-T Easy载体连接，经转化、筛选阳性克隆，进行了核酸序列测定。对核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析表明，猪GM-CSF前体蛋白编码区由435bp组成，编码144个氨基酸，其中N端信号肽有18个氨基酸。在第44、47和54位氨基酸处有3个糖基化位点。与人、牛、羊、小鼠的GM-CSF核苷酸序列的相似性分别为82％、85％、88％和86％，氨基酸序列相似性分别为72％、73％、73％和57％。与人、牛、羊GM-CSF的亲水性和疏水性氨基酸的分布保守性很高，而与小鼠的差异较大。