番茄不孕病毒BJ株系基因组测定与侵染性克隆

番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)可侵染包括藜科(Chenopodiaceae)、茄科(Solanaceae)等在内的24个双子叶家族和3个单子叶家族的100多种植物,是具有重要经济价值的植物病毒之一.为研究TAV BJ株系(Tomato aspermy virus,TAV-BJ)的基因组功能,本实验对TAV-BJ基因组克隆测序,并构建侵染性克隆.以TAV-BJ侵染心叶烟(ic otiana glutinosa)的总RNA为模板,RT-PCR获得其RNA2和RNA3;以TAV-BJ的dsRNA为模板,RT-PCR获得全长RNA1,目的片段PCR产物克隆测序获得TAV-BJ基因组全序列信息.RNA1全长3 409 nt,编码994个氨基酸的1a蛋白;RNA2全长3 023 nt,含2个开放阅读框(open reading frame,ORF),2a ORF编码829个氨基酸的2a蛋白,2b ORF编码78个氨基酸的2b蛋白;RNA3全长为2 216 nt,包含2个ORF,3a ORF编码247个氨基酸的3a蛋白,外壳蛋白(coat protein,CP)ORF 编码219个氨基酸的CP蛋白(TAV-BJ基因组RNA1、2和3 GenBank登录号分别为HQ424163,HQ424164和HQ424165).TAV-BJ基因组cDNA克隆体外转录成RNA并接种于心叶烟上,结果表明转录产物在寄主上的症状反应和TAV-BJ病毒粒子RNA的接种相一致,TAV-BJ基因组cDNA侵染性克隆具有活性.由TAV-BJ各个基因片段与缺失2b基因的黄瓜花叶病毒Fny株系(Cucumber mosaic virus,CMV-Fny△2b)构建的假重组病毒接种于心叶烟,结果显示TAV-BJ的RNA2和RNA3能恢复CMV-Fny△2b在寄主上症状反应.嵌合型RNA3F3aTcp和RNA3T3aFcp的症状反应结果表明,F1F2△2bRNA3 T3aFcp在寄主上产生花叶症状与F1 F2△2bT3相一致.本研究获得TAV-BJ的基因组序列,成功构建侵染性克隆,同时发现TAV-BJ的3a基因具有CMV-Fny的2b基因的某些功能.     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

黄瓜果实苦味(Bt)基因的插入缺失(Indel)标记

为了筛选与黄瓜果实苦味(Bt)基因紧密连锁的插入缺失(Indel)标记,本研究以黄瓜(Cucumis sativusL.)果实苦味和果实不苦的高代纯合自交系46GBt和931为亲本构建的F2分离群体为试材,明确了黄瓜果实苦味性状遗传是符合单显性基因控制的质量性状.同时在完成Bt基因初步定位和双亲重测序的基础上,利用生物信息学分析双亲在初步定位区域的序列差异,设计了7对InDel标记.通过对含有184个单株的F2群体分析,获得了与Bt基因连锁距离为0.8 cM的Indel标记Bt-InDel-1.利用不同于本研究且包含58个单株的黄瓜F2群体材料对Bt-InDel-1的验证分析表明,该标记检测的正确率达到94.8％.本研究结果可用于无苦味黄瓜的分子标记辅助选择(MAS)育种及Bt基因精细定位.     

通过转基因手段改善作物产量性状

在世界范围内,目前的作物转基因研究主要针对于提高作物自身的抗逆性开展,而产量是一个较为复杂的农艺性状,受多种基因与环境的相互作用所控制.其中,光合作用、氮素同化、碳源分配、植株株型等生理过程是产量形成的基础.随着植物基因组测序工程的逐渐完善,控制上述生理过程的许多基因已被成功分离,并通过基因工程手段对其进行遗传修饰,最终获得了产量性状得以明显改善的转基因植物.虽然目前对于基因如何调控每个性状的机制尚未得到充分阐明,但是这些基因的获得及其增产功能的验证为作物的高产育种提供了一条全新的思路和一系列新方法.随着国家转基因生物新品种培育科技重大专项的实施,对功能基因的认识显得尤为重要,本文主要从影响作物产量形成的源、流、库、株型、氮素及水分利用率等几方面入手,对近10年来控制植物产量性状基因的相关研究进行了综述,期望为高产转基因作物新品种的培育提供一定的理论依据.     

镉胁迫对拟南芥幼苗形态生理和错配修复相关基因表达的影响研究

以拟南芥为供试材料,从形态指标、生理指标、分子指标3个层次研究了镉（Cd）的毒理效应,筛选Cd敏感生物标记物。分子指标的研究以18S rRNA为看家基因, 错配修复基因MutS 2 homolog（atMSH2）, atMSH3,atMSH7,细胞增殖核抗原1 和2（atPCNA1和atPCNA2）为检测目的基因,采用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术研究Cd胁迫对上述错配修复相关基因表达的影响。结果表明,不同浓度（0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L^-1）Cd 处理7 d后,根长随Cd胁迫强度的增加而降低; 0.125 mg·L^-1 Cd处理下,地上部可溶性蛋白含量显著增加,而在0.25、1.0和3.0 mg·L^-1 Cd时降低,但仍高于对照;幼苗叶片数、地上部鲜重、叶绿素含量变化与对照相比差异均不显著。地上部atMSH2,atPCNA1,atPCNA2基因表达量的变化与Cd胁迫浓度呈明显的倒U字型关系,分别在0.125,0.25和0.125 mg·L^-1 Cd时达到最大值。以上结果表明,地上部可溶性蛋白含量变化与上述3个错配修复相关基因表达量的改变趋势相符,且均对Cd污染胁迫较敏感,可以作为检测Cd污染及其相关生物学效应的潜在生物标记物。     

改良耕层土壤中苯胺的吸附动力学

研究有机改良土壤对污染物的动力学吸附特征,有助于深入了解其对污染物的吸附机制。以十六烷基三甲基溴化铵单一改良（CB）和十六烷基三甲基溴化铵＋十二烷基磺酸钠混合改良（CS）塿土耕层土样,采用批处理法通过不同的速度参数研究了改良土壤对苯胺的吸附动力学特征,并与苯酚对比探讨改良土样对有机污染物吸附的动力学机制。结果表明,塿土耕层土样的有机改良能够显著加快对苯胺的吸附速度,苯胺的吸附反应呈现快速反应和慢速反应两个阶段,且以快速吸附反应为主。总体上耕层土样Vt、V0.5、Vf的大小顺序均为100CB＆gt;120CS＆gt;（≈）50CB＆gt;CK。随温度升高和苯胺添加浓度增大,苯胺吸附速度增大,苯胺、苯酚的吸附动力学特征在改良土样上具有良好的相似性,从而证实有机污染物以分子状态存在导致的单一疏水吸附是改良土样吸附的决定机制。     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

水稻WRKY基因家族功能研究进展

WRKY蛋白是一类重要的转录因子家族,因含有高度保守的WRKY结构域而得名,主要存在于植物中。WRKY域长约60氨基酸,其靠近N-端有WRKYGQ(K/E)K基序,后面跟有1个C2H2或C2HC锌指型结构。依据WRKY结构域基本结构特征的差异,水稻WRKY家族可以分成3大类,它们通过调控生长调节物质介导的信号途径,广泛地参与调节水稻生长发育和生物与非生物胁迫应答。     

水稻淀粉分支酶基因(RBE4)作为转基因水稻基体标准物质的内标准基因的研究

内标准基因(endogenous reference gene)是指具有物种专一性、不显示等位基因变化、拷贝数恒定的保守DNA序列,对基因定量分析时具有重要意义.本研究选取了5个水稻内标准基因:根部表达的水稻基因(rice root-specific,GOS9)、磷脂酶D基因(phospholipase D,PLD)、蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase,SPS)、水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)、泛素蛋白基因(ubiquitin 5,UBQ5)和2个外源基因:苏云金芽孢杆菌CrylAb杀虫晶体蛋白基因CrylAb和cryl Ab/cryl Ac融合杀虫晶体蛋白基因(CrylA c/CrylAb),分别以转基因水稻(Oryza sativa L.)克螟稻2号和TT51-1为模板,比较各自的外源基因(CrylAb =KMD2和CrylA c/CrylA b=TT51-1)与5个内源基因的PCR产物量,筛选出和外源基因PCR产物量最接近的内标准基因为RBE4.在此基础上,数字PCR不依赖于已知浓度的标准曲线来定值,可以避免标准样品的标准曲线和样品目的基因的扩增曲线在扩增效率上的不一致等因素所带来的误差,定值结果更加准确、可靠,采用数字PCR分析外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值,荧光定量PCR方法分析内标准基因RBE4和外源基因的定量检测稳定性、灵敏度等.结果表明,外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值在转基因水稻克螟稻2号和TT51-1上都较接近于1∶1,分别为115.9％和105.3％.RBE4的荧光定量PCR体系重复性、定量检测稳定性和灵敏度好,符合作为转基因水稻基体标准物质定量分析的内标准基因的要求,RBE4定量体系在TT51-1和克螟稻2号的最小检出限(LOD)分别为5～11 copies/μL和3～12 copies/μL,最小定量限(LOQ)分别为11～22和12～24 copies/μL.RBE4是转基因水稻标准物质研制和产品定量检测的适宜内标准基因.研究结果为转基因作物标准物质研制和定量检测的内标准基因选取提供一定的参考.