同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.     

体细胞克隆与动物乳腺生物反应器

自从20世纪80年代美国科学家Gordon等人首次利用小鼠乳腺生产出人类医用蛋白质-tPA之后，生物反应器立即引起了科学界和企业界的巨大关注，大量的风险资金开始投向动物生物反应器的开发，一批以生物反应器作为技术支柱的新型制药公司也纷纷建立起来。通过基因打靶技术在转基因绵羊、猪等哺乳动物乳汁中已经得到了大量同源重组人蛋白。科学界和企业界都相信，生物反应器技术将在本世纪初形成低投入、高产出的巨大生物产业，是生物技术中最具前景的高技术之一。     

ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶Fat-1基因打靶的水牛肾脏成纤维细胞的制备

Fat-1基因能协调ω-6多聚不饱和脂肪酸与ω-3多聚不饱和脂肪酸之间的比例,可提高动物体ω-3多聚不饱和脂肪酸的含量,为提升水牛乳品质提供了一个有效的方法。本研究构建了水牛乳腺特异性多位点基因打靶载体,分离和培养了新生胎儿水牛肾脏成纤维细胞。采用电击法转染、克隆环法筛选和纯化了水牛肾脏成纤维细胞克隆,经绿色荧光蛋白表达观察、PCR和DNA序列检测获得了已整合Fat-1基因的细胞克隆,为制备定点整合Fat-1基因的体细胞克隆水牛提供核移植供体。