马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化 及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列，设计一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒RNA为模板，克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因，在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中，获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断，说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明，在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明，转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性     

胞质型磷脂酶A2基因克隆及其表达量随大黄鱼仔稚鱼生长发育的变化

利用同源克隆技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆大黄鱼胞质型磷脂酶A2(cPLA2)基因的cDNA全长.此外,应用实时定量PCR法检测不同日龄大黄鱼仔稚鱼cPLA2基因的表达量.序列分析结果表明:cPLA2基因全长2 550 bp(GenBank登录号:KF006240.1),其中5'端非编码区176 bp,开放阅读框2 169 bp,3'端非编码区205 bp,共编码723个氨基酸.系统进化树分析结果表明:克隆所得大黄鱼cPLA2基因与其他鱼类的cPLA2基因亲缘关系较近,与哺乳动物的亲缘关系较远.定量检测结果表明:大黄鱼仔稚鱼cPLA2基因的表达量随日龄的增加为先显著升高(1、3、7日龄vs.15日龄,P＜0.05),在15日龄时达到最高值,随后显著下降(15日龄vs.19日龄,P＜0.05),之后趋于平稳.由此可知,大黄鱼从仔稚鱼到幼鱼早期的变形过程中,磷脂分解代谢的关键酶cPLA2基因的表达量呈现有规律的变化,这可能对机体保持体内磷脂的动态平衡、维护细胞膜的流动性具有重要的意义.大黄鱼仔稚鱼cPLA2基因表达量的变化趋势在一定程度上可以衡量大黄鱼消化系统的发育情况.     

正链RNA病毒感染性克隆的构建策略及影响因素

利用全长cDNA构建感染性克隆是拯救RNA病毒的基础和关键,也是反向遗传技术的核心。文章综述了构建正链RNA病毒感染性克隆的基本思路和关键技术,总结了影响克隆感染性的因素,并对感染性克隆技术的应用做一简述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

腐烂茎线虫热激蛋白新基因的克隆与序列分析

热激蛋白90基因(heat shock protein 90 genes,hsp90s)是与生物发育、生物防御反应以及生物抗环境胁迫等相关的多功能基因.本试验以RT-PCR结合RACE方法从腐烂茎线虫Dhtylenchus destructor中克隆出1个hsp90,命名为Dd-hsp90-1,基因登录号为HQ9015...     

水稻基因启动子Ospz1的克隆与表达特性研究

在水稻基因组芯片分析的基础上,克隆到一个在水稻中高水平表达基因OsSG15'末端启动子区域1.6-kb的DNA片断,即Ospz1启动子,构建了由Ospz1启动子引导的GUS重组基因,并经农杆菌介导将重组基因导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性测定结果表明,Ospz1启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片、芽和根中高效表达,而在其它器官中不表达或表达活性极弱,表现出组织特异性.Ospz1启动子可用于农作物生物技术的遗传改良.     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)血清抗体的间接ELISA方法,将TGEV的N基因片段克隆到p ET-28a载体中,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并对表达的蛋白进行Western-blot鉴定。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,最终建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法。该ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等5种病毒阳性血清不发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。本研究可为猪传染性胃肠炎的流行病学调查、诊断与防控奠定基础。     

一品红转化酶基因片段的克隆和序列分析

根据植物酸性转化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以一品红基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段,克隆入pM D-18T载体,测序结果表明:获得1个一品红酸性转化酶基因家族的成员,该基因片段长523 bp,编码173个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在G enB ank中进行同源性检索的结果表明,该成员编码的氨基酸与其他植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能,并对其进行生物信息学分析,检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物,PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序,利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树;获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点,预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型;利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示,草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp,编码464个氨基酸,其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%）,与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄,分子质量为50.924 ku,理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50,氨基酸残基多数为亲水性残基,总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明,Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中;磷酸化位点分析发现,Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%）,三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示,Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高,在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性,其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定,属于水溶性蛋白,在线粒体和内质网中发挥作用,在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。