植物基因启动子的克隆方法及其应用

植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点,启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR的克隆启动子技术,如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法,分析了它们的优缺点,并展望了今后的研究前景。     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

克隆植物中国沙棘种群稳定性维持途径的探讨

中国沙棘属于阳性树种,因此有些学者将其视为群落演替过程中的先锋种群,而有些学者的研究表明它在自然状态下更新良好。近年来的研究进一步证明,中国沙棘能够依靠克隆生长所赋予生理整合和觅养行为等特性提高环境资源的利用效率以及自身的繁殖和生存有效性,通过林窗更新和林缘扩散等途径维持种群的稳定性和持久性。     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料,利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段,将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序,结果证明,此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBIFe,并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

马疱疹病毒1型UL56蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备马疱疹病毒1型（EHV-1）UL56蛋白（pUL56）的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示,纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应;pUL56多克隆抗体的效价为1∶128 000,并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体,为pUL56功能特性及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。     

杧果细菌性角斑病菌phd基因克隆与序列分析

由柑橘黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv．mangiferaeindicae, Xcm)引起的杧果细菌性角斑病是杧果上的一种重要细菌性病害,严重危害杧果产业发展。为了研究抗毒素phd基因的结构和功能,本试验通过在NCBI上选取已被注释的Xcm抗毒素phd基因的序列,设计出引物phd-F和phd-R,从Xcm003菌株中扩增出258 bp的DNA片段,提交至NCBI的登录号是MH401645。经序列分析该片段是一个完整的phd基因,编码85个氨基酸,其理论分子量9.68 kD,理论等电点为9.39,是一种亲水性蛋白,无信号肽,有6个磷酸化位点以及一个结构域。系统进化树结果显示,该基因的氨基酸序列与Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae LMG941的Phd蛋白聚为一类。通过克隆杧果细菌性角斑病菌phd基因并对其进行生物信息学分析,为深入研究phd基因做基础。     

甘蔗宿根矮化病病原菌致病因子pglA基因的序列分析与原核表达

多聚半乳糖醛酸内切酶（endo-PG）是植物与微生物互作中极其重要的细胞壁降解酶,是病原菌定殖寄主与产生致病性的必需因子,革兰氏阴性菌Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)是甘蔗宿根矮化病的致病菌,pglA是Lxx的关键致病因子。为了揭示pglA基因的功能,本研究采用重叠延伸PCR的方法获得了pglA基因的开放阅读框（ORF）,ORF长1491 bp的,编码496个氨基酸,序列保守结构域包含Gly＿hydro＿28 (Polygalacturonase)与Rho超家族,与Lxx CTCB07、Lxc DSM46306归为一类,相似性达100%。氨基酸序列分析显示,pglA蛋白属于疏水性蛋白,包含信号肽和跨膜区。在大肠杆菌中表达纯化获得pglA蛋白,以包涵体的形式存在于菌体中。研究结果为进一步进行Lxx的致病机制研究奠定了基础。     

猪乙脑病毒HW株的全基因组克隆及分析

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种中枢系统人畜共患急性传染病,由蚊为媒介传播,以高热和狂暴或沉郁等神经症状为特征[1],猪患乙型脑炎的主要症状表现为怀孕母猪流产,产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,使养猪业遭受巨大损失。1988年我国学者方