染色质免疫沉淀技术（ChIP）在基因转录调控中的作用

目的研究体细胞水平蛋白（转录因子）与DNA（靶基因启动子区）的相互作用.方法用甲醛固定活细胞,在生理状态下,结合的蛋白质-DNA复合物呈交联状态,超声将DNA打断成不同大小的片段,用目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物,复合物65℃解交联,并分离纯化DNA,然后进行PCR扩增.结果PCR扩增出阳性条带.结论ChIP是一项在不同生理条件下探测转录因子与DNA结合的成熟技术.     

牙龈卟啉菌菌毛基因在转基因番茄果实中的特异表达及小鼠免疫实验

将编码牙龈卟啉菌菌毛蛋白（Fimbrillin,FimA）（第266-337Aa）与霍乱毒素B亚基（CTB）基因用农杆菌侵染法转入番茄植株,并利用番茄果实特异启动子E8使其在果实中实现特异表达,然后用特异表达的转基因番茄果实对实验小鼠进行口服免疫实验,研究转基因番茄果实的免疫原性。实验结果表明：获得的11株转化植株中,共有9株重组了CTB-FimA基因的植株在番茄果实中实现了特异表达;口服转基因番茄果实的免疫小鼠的血清中检测到抗FimA抗体;获得了以CTB为佐剂的在番茄果实中特异表达牙龈卟啉菌菌毛基因的植物口服疫苗候选植株。     

高等植物ACC氧化酶基因启动子研究进展

启动子是控制植物基因表达的重要DNA序列结构,本文从高等植物ACO基因启动子克隆、顺式作用元件分析及GUS基因表达等方面着眼,综述该领域的研究进展。     

种子贮藏蛋白的基因启动子及其应用研究概述

在简述种子贮藏蛋白组成的基础上,对醇溶蛋白和谷蛋白等主要谷类种子贮藏蛋白的基因启动子研究进展进行了概述,特别是对调控种子贮藏蛋白基因种子特异性表达的重要顺式作用元件,如AACA基序、GCN4基序和醇溶蛋白框等的结构和功能给予了较详尽的介绍。同时,对种子贮藏蛋白基因启动子在生产目的基因产物、定向改良作物农艺性状等方面的应用进行了综述,并提出了存在的问题与展望。     

草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。［方法］采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。［结果］从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。［结论］该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。     

不同启动子在水稻悬浮细胞中诱导外源基因的表达

为进一步提高外源基因在水稻悬浮细胞中的表达水平,以花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子为对照,克隆了玉米泛素蛋白启动子(Ubi)、水稻肌动蛋白启动子(Actin)以及水稻Oscc1启动子,以GFP为报告基因,通过启动子串联的方式,构建了10个植物表达载体:p CAMBIA 1304 35S-GFP、Ubi-GFP、Actin-GFP、Oscc1-GFP、35S/Ubi-GFP、35S/Actin-GFP、35S/Oscc1-GFP、Ubi/Actin-GFP、Ubi/Oscc1-GFP、Actin/Oscc1-GFP,采用根瘤农杆菌介导的方法,将表达载体导入日本晴胚性愈伤,经悬浮培养分别获得转基因的悬浮细胞系,利用荧光显微镜、酶标仪检测GFP荧光强度,用Western blot检测GFP蛋白质的表达水平。结果发现串联启动子明显强于单个启动子驱动的GFP蛋白质表达水平。在10个表达载体中,35S/Ubi、Ubi/Actin和Ubi/Oscc1是3种优化的启动子组合,其中Ubi/Oscc1串联启动子驱动GFP的表达水平最高,约为对照35S启动子的3倍。     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.     

玉米转录因子EREB58启动子分析

玉米EREB58转录因子能够调控萜类合成酶基因TPS10的表达,启动玉米抗虫间接防御体系。但是目前对于EREB58的转录调控机制还是未知。克隆得到EREB58基因的1 193 bp的启动子序列,通过生物信息学分析发现在启动子序列中存在多个与植物防御相关的顺式作用元件,如ABRE、Box-W1、GARE motif和TCA元件。将不同长度5’端缺失的启动子与GUS报告基因相连构建植物表达载体转化拟南芥,转基因拟南芥进行GUS组织化学染色和GUS酶活性分析,结果显示:正常情况下EREB58PF1-PF7和PF9无GUS染色,但PF8有GUS染色;Me JA或亚洲玉米螟处理后PF1-PF7有GUS染色,PF8无明显变化,PF9仍无GUS染色。GUS酶活性分析与GUS组织化学染色结果一致。以上结果表明:EREB58启动子的-323至-270和-270至-183区段是启动子的功能区段,且-323至-273区段含有抑制EREB58基因转录的顺式作用元件,-273至-183区段是EREB58基因转录所必需的,这为后续研究EREB58的转录调控机制奠定基础。     

LAT52启动子在甘蓝花药中的表达模式

[目的]验证花药特异性启动子LAT52能否在甘蓝花药中发挥功能。[方法]从番茄中扩增得到LAT52核心序列608 bp,进行序列分析,连接LAT52启动子到双元表达载体p BI121,转化农杆菌GV3101,用农杆菌浸染法侵染甘蓝幼苗下胚轴,获得2株阳性植株,对转基因甘蓝植株的花蕾、花药及花粉进行GUS染色。[结果]LAT52核心序列608 bp具多个与花粉特异性表达相关的元件,浸染的LAT52启动子仅在花药及花粉中表达出蓝色,其他部位未染上蓝色。[结论]LAT52启动子仅在甘蓝花药及花粉中特异性表达。     

粪源环丙沙星对潮土中抗生素抗性基因的影响

为了探究粪源环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)对潮土中抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)的影响,布置培养试验(81 d),设置5个处理,分别为Ⅰ:CK(对照),Ⅱ:CIP(外源添加CIP),Ⅲ:DF(不含CIP的鸭粪),Ⅳ:DF+CIP(Ⅲ基础上外源添加CIP),Ⅴ:DF(CIP)(粪源CIP)。采用PCR技术分析土壤中6大类27种抗生素抗性基因和4种可移动遗传元件的检出情况,并利用荧光定量PCR技术对检出频率较高的目的基因及总细菌基因(16S rRNA)的绝对丰度进行检测。结果表明:不同处理土壤中共检出6种ARGs(tet G、sulⅠ、qnr A、qnr S、aad A2、aad D)和1种可移动遗传元件(intⅠ),且检测到的目的基因基本一致。DF(CIP)和DF+CIP处理对土壤中细菌和不同种类ARGs的影响不同。DF(CIP)、DF+CIP处理均显著降低了土壤中16S rRNA、tet G的绝对丰度;DF(CIP)处理显著增加了土壤中sulⅠ、aad A2的绝对丰度;DF+CIP处理显著增加了土壤中qnr A的绝对丰度。不同种类的ARGs与intⅠ、土壤理化性质的偏相关性分析表明,土壤中intⅠ与sulⅠ、aad A2呈正相关,与qnr A呈负相关,qnr A与CIP残留量呈正相关,tet G与有机质呈正相关。研究结果可为科学地评价氟喹诺酮类抗生素的环境风险以及粪肥的合理施用提供一定的理论依据。