高致病牲蓝耳病PCR诊断及病毒分离鉴定

某种猪场经产母猪群出现以体温升高(41-42℃),食欲减少甚至废绝,部分怀孕母猪流产.仔猪皮肤发绀和呼吸困难为特征的疾病.经RT-PCR检测及病毒分离鉴定,确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株感染引起的高致病性蓝耳病.     

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10⁹—1.019×10²copies/μL时,相关系数R²为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。     

猪流行性腹泻病毒河南分离株全基因扩增及序列分析

为进一步了解我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)的分子流行病学特征,从阳性病料中分离得到1株河南毒株(命名为HeN17-2011),设计13对引物,对分离株HeN17-2011的基因序列进行RT-PCR扩增和全基因组3′Race、5′Race扩增,通过产物回收、转化和测序,经生物软件拼接,成功获得其全基因序列,并与近十几年的流行毒株进行了序列比对分析。结果显示:分离株HeN17-2011基因组全长为28 038 bp(不含polyA尾),基因组结构为5′UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3′UTR,与PEDV基因组的结构特征相符;通过与GenBank中已发表的国内外毒株ZJCZ4、CV777、DR13等26株PEDV序列进行比对发现,HeN17-2011与NW8的同源性最高为99.4%,与标准株CV777、韩国毒株DR13(JQ023161.1)和DR13(JQ023162.1)、美国毒株Illinois261、意大利毒株PEDV-1842-2016-ITA的同源性分别为96.9%,97.7%和97.3%,99.2%,98.7%,与SD-M的同源性最低为96.4%;PEDV分离株HeN17-2011与标准株CV777、韩国毒株DR13处于不同的分支上,遗传关系较远,属变异毒株,但与我国的流行毒株CH-SCZY103-2017、NW8等遗传关系较近;通过对全基因组序列分析发现,我国PEDV流行株在ORF1b、ORF3、E基因、M基因和N基因上的长度是保守的,它们虽然均存在点突变,但没有碱基的插入和缺失,我国流行株基因组长度变化主要与5′UTR、ORF1a、S基因、ORF3和3′UTR的碱基插入、缺失密切相关。     

应用RT-PCR检测人工感染鸡体内禽呼肠孤病毒的动态分布

应用一步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测禽呼肠孤病毒(ARV)在人工感染SPF雏鸡体内的动态分布情况。结果3日龄感染ARVS1133毒株后,12h就可以从关节、肝、脾等组织中检出病毒的RNA,感染后3—7天为检出的高峰期,至感染后27天还可从附关节组织检测到：在11种不同绀织中．均不同程度地检测到病原的核酸,其中以关节组织检出率最高(80．9%),其次为肝(67．6%)、脾(55.9％)、肾(50．0％),肛门棉拭子的检出率最低(13．2％),显示了ARV在感染机体内的动态分布情况。     

新生仔猪急性腹泻疫情中5种病毒感染的分子检测

为查明河南省新生仔猪急性腹泻疫情的主要病因,研究分别应用RT-PCR和PCR方法对98个猪场送检的181份发病仔猪病料进行了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(GARV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的分子检测。结果显示,PEDV阳性检出率高达71.27%,与TGEV、GARV、CSFV和PRV的混合感染阳性检出率分别为2.76%、2.21%、56.91%和17.13%,与CSFV、PRV的三重混合感染阳性检出率为17.10%,而与TGEV、GARV的三重混合感染阳性检出率仅为0.55%;TGEV、GARV、CSFV和PRV的阳性检出率分别为5.52%、2.21%、69.06%和44.20%,CSFV和PRV的混合感染阳性检出率为32.04%;腹泻病原检测阳性猪场在河南省分布较为均匀,秋、冬季节比例较多,但春、夏季季节呈逐步上升趋势;规模化猪场阳性场所占比例远高于中小型猪场。研究结果证实新生仔猪急性腹泻疫情在河南全省猪场感染和流行极为普遍;季节性已日趋不明显;PEDV是引起此次疫情的最主要病因,但CSFV和PRV扮演着推波助澜的重要角色。     

应用RT-PCR对新城疫病毒分离株毒力的快速鉴定

根据新城疫病毒 (NDV)强、弱毒株在 F蛋白裂解位点氨基酸组成和序列上的差异 ,参照有关文献 ,设计了 3对引物 (A B,A C,A D)。引物 A B能从 L a Sota、B1 、 系和强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 36 2 bp的核酸片段 ,引物 A C仅能从强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp的片段 ,引物 A D仅能从 L a Sota、B1 、 系的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp片段。 3对引物均不能从 IB、IBD、AI的含毒尿囊液和正常鸡胚尿囊液中扩增出特异片段。从发病鸡群中分离的 3株 NDV毒株均被 A C引物扩出 ,它们的鸡胚平均死亡时间 (MDT)分别为 5 1.8、5 3.2、5 2 .6 h,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 1.6 5、1.6 3、1.6 0 ,证明是 NDV强毒。利用 RT- PCR对 NDV人工感染鸡最早可于攻毒后第 2天从病鸡气管中检测到 NDV,其次为泄殖腔和脾、肾。利用 RT- PCR对 NDV毒力的鉴定结果与传统生物学试验的测定结果完全吻合 ,但前者可在 2 4 h内直接对组织匀浆进行诊断 ,具有快速、简便和敏感的特点     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

不同咸蛋腌制温度对禽流感毒灭活的影响

经人工接种H9亚型禽流感病毒(AIV)的鸭蛋,分别在12℃、22℃和32℃条件下按常规方法腌制于饱和盐水中,同时以置饱和盐水中的禽流感病毒和未经处理禽流感病毒样品作为对照,通过MDCK细胞培养、间接免疫荧光方法定期进行禽流感病毒毒力测定,结果在12℃、22℃和32℃条件下腌制鸭蛋中的禽流感病毒分别于49天、27天和4天失去毒力,置饱和盐水中的禽流感病毒分别在27天、9天和2天失去毒力,而未经处理的禽流感病毒分别在92天、29天和17天失去毒力;不同试验温度条件下,以荧光RT-PCR检测腌制鸭蛋和对照样品中的禽流感病毒,在100天后仍可检出病毒核酸(Ct<30)。以上检测结果表明,在腌制鸭蛋时于常温下置饱和盐水腌制40天以上的传统咸蛋生产工艺,可使禽流感病毒完全失去毒力,腌制的鲜咸蛋携带或传播禽流感病毒的风险极低或不存在风险。     

Ghrelin对莎能奶山羊垂体催乳素和生长激素mRNA表达的影响

垂体催乳素和生长激素对雌性哺乳动物泌乳的启动和维持以及乳腺的发育都发挥着重要的调节作用.为探讨ghrelin对奶畜泌乳的调节作用,10只泌乳期莎能奶山羊随机分为2组(试验组和对照组),每组5只.试验组羊静脉注射ghrelin(3.0μg/kg)3 h后检测垂体催乳素(Prolactin,PRL)和生长激素(Grouth hormone,GH)mRNA的表达,结果显示一定剂量的ghrelin对催乳素mRNA的表达具显著上调作用(P<0.01);对生长激素mRNA的表达也有显著促进作用(P<0.01).结果表明,ghrelin在垂体水平上对催乳素和生长激素mRNA的表达具有上调作用,提示ghrelin可能通过对这些激素的作用参与了对奶畜泌乳的调节.