Mariner转座子与小菜蛾抗性关系的研究

以抗溴氰菊酯、杀虫双、杀螟丹小菜蛾种群及其敏感品系为研究对象,借助聚合酶链式反应(PCR)、载体筛选、琼脂糖凝胶电泳等实验技术,检测了小菜蛾4个品系的Mariner转座子的存在及其与抗性的关系。结果表明,在抗溴氰菊酯、杀虫双、杀螟丹以及敏感品系的小菜蛾中都存在两种大约500 bp的Mariner转座子片断,初次证明在小菜蛾4个品系中均含有两种Mariner转座子,并发现一种新的转座子基因片断,但是没有发现Mariner转座子与抗性之间存在直接的联系。研究结果将为利用Mariner转座子标签法在小菜蛾中分离定位基因、转化外源基因、转基因昆虫防治害虫等研究提供理论基础。     

苹果茎沟病毒部分分离物的生物学特性与分子鉴定

通过昆诺藜接种鉴定和ELISA检测,从梨和苹果上分离获得苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)23个分离物.采用TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均获得特异的扩增片段,PCR产物经5%PAGE电泳,出现大小约500、530和600bp的3种迁移率不同的泳动带型.根据PCR产物电泳迁移率的差异,选取3个来源于梨的分离物P-L4、P-6-1-17和P-3-2-67的PCR产物进行克隆与序列测定.经BLAST搜索,3个分离物的扩增片段与苹果分离物P-209的CP基因3′端核苷酸序列同源性分别为92.2%、90.4%和88.4%.3个分离物间的核苷酸序列也有较大差异,P-L4/P-6-1-17为95.5%、P-L4/P-3-2-67为90.4%、P-6-1-17/P-3-2-67为88.6%.     

荧光定量PCR中至少应提供的信息(MIQE)

荧光定量PCR也称qPCR(quantitative PCR),是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,然后结合相应的软件对待测样品模板的起始浓度进行定量。目前,人们对实时定量PCR的操作规范和试验结果分析缺乏共识,许多发表的文章中缺乏足够的试验细     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。     

耐药基因blaTEM-1、blaIMP-3、fosA3多重重组聚合酶扩增(RPA)快速检测方法的建立和应用

为了建立同时检测多种耐药基因的快速检测方法,本研究以bla_TEM-1、bla_IMP-3、fosA3基因保守序列设计特异性引物,经优化反应条件,建立恒温检测上述3种耐药基因的多重重组聚合酶扩增(RPA)方法。条件优化结果显示,所建立的RPA方法在引物浓度为480 mmol/L,37℃恒温反应20 min时检测效果最佳。该方法对携带bla_TEM-1、bla_IMP-3、fosA3基因的菌株能扩增出条带,阴性菌株无条带,特异性高;对bla_TEM-1、bla_IMP-3基因的最低检出限为1.8×10¹拷贝/μL,对fosA3基因的最低检出限为1.8×10²拷贝/μL,敏感性较强。用多重RPA方法对浙江省内水产养殖环境及生物体中分离到的400株菌株进行检测,养殖用水分离菌株的bla_TEM-1、bla_IMP-3和fosA3检出率分别为81.00%(81/100),11.00%(11/1...     

花生果种皮特异表达基因候选片段的分离

应用改良的琼脂糖凝胶电泳展示DDRT-PCR产物的方法分离花生果种皮特异表达基因,共分离出24条差异表达片段.经测序后排除重复,最终得到8条差异片段.其中1条为花生上已知基因片段,余下7条均为花生上尚未报道过的基因.此7个片段序列已登录Genbank,其登录号分别为DQ450065、DQ450066、DQ450067、DQ450068、DQ450069、DQ450070、DQ450071.同时本研究还对应用琼脂糖电泳分离DD-PCR产物的方法进行了探讨.     

山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

从山东某地区发生呼吸道症状的奶牛场中采集样品,按常规方法处理后,接种牛肾细胞(MD-BK),分离病毒,盲传3代后,接种病料的MDBK细胞出现细胞圆缩、聚集成葡萄串样群落、在单层细胞上形成空洞等病变,且随着传代次数的增加,细胞病变更加规律。对所分离病毒进行TCID50测定,其TCID50值为108/ml;用IBRV特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,序列测定分析结果确认所分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒。     

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。