春兰基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

以春兰为研究材料,对春兰基因组DNA的提取以及RAPD-PCR反应体系进行了优化。结果表明,在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇去除酚类物质,采用高盐沉淀DNA和多次洗涤去除糖类,可以得到高质量春兰基因组DNA。电泳检测表明,所获得的DNA完整,无降解,完全可以满足R-APD等分子标记分析的需要。同时对春兰RAPD-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化,建立了适合春兰R-APD分子标记的最佳反应体系,即20μl反应体系中含1UTaqDNA聚合酶,60μmol／L dNTPs,2．25mmol／L Mg^2＋,1．0μmol／L引物,1．5ng／μl模板DNA。     

苹果茎沟病毒RT-PCR检测技术

用苹果的叶片作为材料,研究比较了两种提取苹果总RNA方法的效果,确定了较好的提取方法。根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因设计引物,通过RT-PCR扩增在苹果叶片总RNA样品中获得了524 bp的特异片断,通过对该片段的序列分析与苹果茎沟病毒外壳蛋白基因源序列比较,其同源性高达93%。通过多次重复实验验证,该方法能很好地检测苹果茎沟病毒。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA29，设计了1对引物和3条探针，建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR-ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针，边扩增边检测，步骤简单，不需PCR后处理，可避免假阳性和交叉污染；诱捕PCR-ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测，减少了核酸不纯出现的漏检，由于增加了核酸杂交探针，可不需凝胶电泳EB染色检测，不会出现假阳性问题。     

一种基于RPA的番茄褪绿病毒检测方法

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。     

燕麦C基因组反转录转座子分离与特异性标记的建立

燕麦属是禾本科中重要的属,其中,栽培燕麦是一种营养价值很高的粮、经、饲、药多用途作物,而野生物种中则含有多种优良农艺性状基因,是遗传改良的重要资源。基因组和染色体特异性的分子标记是分子育种工作的重要工具,以燕麦属不同倍性和基因组物种为材料,利用300条随机引物(random amplified polymorphic DNA,RAPD),从燕麦C基因组中筛选到一条基因组特异性序列OPR51655;比对和原位杂交发现,OPR51655为一Ty1-copia型反转录转座子重复序列,其同源序列分布于除端部和着丝粒外的整个染色体臂上;根据OPR51655建立了燕麦C基因组特异性(sequence-characterized amplified region,SCAR)标记,利用该标记能有效地检测燕麦栽培种和野生种中的C基因组染色质。     

3个品种猪生长激素基因的多态性分析

采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaⅠ、DraⅠ、MspⅠ 3种限制性内切酶检测酶切位点的多态性.结果显示：ApaⅠ酶切时,3个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB）,BB基因型的频率以大约克夏猪最高,AB基因型的频率以香猪最高,3个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P＞0.05）;Dra Ⅰ酶切时,各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;Msp Ⅰ酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD）,香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性.结论：AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraⅠ和Msp Ⅰ酶切位点的多态性比较贫乏.     

瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术

研究了不同大小的瓯柑茎尖分生组织进行微芽嫁接脱除黄龙病病原的效果。在双目实体显微镜下,分别切取含有生长锥及1、2、3和4个叶原基的茎尖分生组织嫁接到黄化砧木上,以获得茎尖微芽嫁接苗,用PCR进行黄龙病分子检测。试验表明:用含1个和2个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗全部不带病毒;含有3个和4个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗其脱毒率分别为95.7%和73%,感病母株和长春花阳性对照可以扩增出535 bp的特异性片段;尽管在含2个叶原基条件下获得的STG成活率为47.7%,但可以达到理想的脱毒效果。试验还证明,瓯柑二次嫁接与茎尖嫁接直接移栽苗的生长量差异极显著。     

SYBR GreenI定量RT—PCR快速检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

针对H5亚型禽流感H基因保守序列设计引物,建立基于sYBRGreenI检测模式的荧光定量RT—PCR（real—timeRT—PCR,RRT—PCR）,最低检测限为2．1&#215;10^2拷贝质粒DNA,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm=（79．5&#177;0．3）℃,对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其它家禽常见病原RNA无扩增,可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2．99％和5．12％;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需5h。