牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化E．coli BL21（DE3），成功地获得了重组菌E．coli BoPrP（23～242）、E．coli BoPrP（100～242）、E．coli CaPrP（25～241）和E．coli CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在原核细胞中的高效表达

从含有LT全毒素基因操纵子的质粒EWD299中扩增出LT的B亚单位基因后定向克隆于原核表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，用IPTG诱导表达后，将全茵裂解，用SDS—PAGE和Western blot检测重组茵中外源蛋白的表达情况。结果表明，在原核细胞中高效表达了LTB蛋白，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的38％。     

H5亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在原核细胞中的表达

以RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒A/DKZJ/12/00(H5N1)中获得禽流感病毒NS1的部分基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a,将测序和酶切验证正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白质电泳表明该蛋白得到了可溶性的表达,表达蛋白的分子量27 kD;Western-blot分析表明,该蛋白可以与禽流感H5阳性血清反应,具有良好的免疫原性.     

重复序列设计原核细胞差异显示RT-PCR引物研究进展

由于原核细胞mRNA3'端不存在ploy(A)结构,因而原核细胞DDRT-PCR引物设计不同于真核细胞。尽管不能根据oligo(dT)设计引物,但利用全基因中高度分散重复的短序列或回文序列却能有效地克服mRNA分子结构影响,最大限度地扩增全长cDNA。并且这两种引物设计方法还可以提高RNA指纹图谱的重复性,降低反应的假阳性,为原核细胞DDRT-PCR引物设计提供新的思路。     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。