鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒单链抗体文库构建及筛选

为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体。本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力。结果成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×10~(10) PFU/mL,通过4轮吸附-洗脱-富集筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体。该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础。     

固氮粪产碱菌胞外多糖的理化特性分析

ＥＰＳ结构分析表明，ＥＰＳ突变株及工程菌株的糖骨架结构与野生型菌株相比有差异，尤其是ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ基因结合子Ａ１５３２的糖骨架结构明显不同于其它菌株，各个菌株之间，其侧链基因均稍有改变。ＥＴＩＲ证实，各个菌株ＥＰＳ中蛋白构象存在差异，ＥＰＳ中均有丰富的β折叠构象。ＥＰＳ丰富型突变株中无规卷曲构象所占比例较大，而野生型菌株中ＥＰＳ则没有无规卷曲构象。     

抗鹅α-干扰素单链抗体基因扩增与表达

为制备抗鹅α-干扰素的单链抗体,以抗鹅α-干扰素的杂交瘤细胞株总RNA为模板,RT-PCR法扩增鹅α-干扰素的抗体轻、重链基因,再采用SOE-PCR法,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3为接头,组装出完整的鹅α-干扰素的单链抗体可变区片段(Sc Fv)基因,并将Sc Fv基因克隆到p GEMT-Easy载体中进行测序分析,将测序正确的Sc Fv基因片段克隆入p ET-30a载体中进行诱导表达。结果显示,成功组装了Sc Fv基因,其全长为726 bp,为VH-Linker-VL结构,其中VH长357 bp、VL长324 bp,成功表达了Sc Fv蛋白,大小为27 ku。     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增，扩增产物经克隆和测序显示，其长度为1893bp，该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H—FABP基因第2内含子分别有99％和66．4％的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H—FABP基因第2内含子中174bp的序列进行了PCR—SSCP分析，结果未检测到多态性。     

牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD.阳性质粒转化宿主菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下获得高效表达.Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点.利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性.     

HIV VRC01单链抗体的构建、原核表达及纯化

【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行变性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行初步纯化。【结果】得到了VRC01的2种单链抗体的基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,其大小分别为770和768bp。SDS-PAGE电泳结果显示,scFv-VH-Linker-VL在大肠杆菌中不表达或表达量极低;而scFv-VL-Linker-VH表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测结果证实,scFv-VL-Linker-VH可与His-Tag融合表达,并通过亲和层析法成功纯化获得了该单链抗体。【结论】成功构建、表达并纯化出了VRC01单链抗体,为进一步研究VRC01单链抗体的生物学特性奠定了基础。     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体库,库容约为1.1×105,滴度为1.3×108pfu。随机选取10个克隆进行双酶切鉴定,结果显示均有ScFv基因片段插入。抗DON毒素单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达抗DON毒素单链抗体奠定了基础。     

牛Myostatin基因单核苷酸多态性分析

Myostatin基因即肌肉生长抑制素，是一种肌肉生长的负调控因子。应运PCR-SSCP和测序的方法对中国秦川牛、南阳牛以及国外引入品种皮埃蒙特牛双肌基因的第三外显子进行了多态性分析。结果表明：第三外显子938处G→A的单核苷酸的突变造成了南阳牛、皮埃蒙特牛第三外显子扩增片段多态性,秦川牛则不然。     

利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片对鲤基因进行分型

单核苷酸多态性(SNPs)标记在大多数物种基因组中数量巨大且分布均匀,是许多水产物种遗传研究的理想标记,因此快速发展了几种高通量、快速的SNP标记分型平台。本研究利用Golden Gate分析技术对鲤Cyprinus carpio转录组测序的1 536个SNP标记合成了一张中等密度SNP芯片,对5个鲤群体的480份样本进行基因分型。结果表明:1 235个SNP标记成功分型,约占80%;915个标记至少在一个家系中呈现多态性,占74.1%;标记最小等位基因频率(MAF)介于0.05~0.5之间,平均为0.334,其中48.9%的标记最小等位基因频率(MAF)大于平均值;5个群体中SNP标记平均多态性信息含量(PIC)在0.3左右,为中度多态,杂合度为0.010~0.990,平均为0.5左右,暗示群体具有丰富的遗传多态性,育种价值及性状改良潜力很大。本研究分型的多态性SNP标记可广泛应用于遗传多样性研究、标记-性状关联分析以及分子标记辅助育种。     

甘肃新选育党参品系与主栽品种的RAPD分析

采用RAPD分子标记技术,分析了新选育党参（Codonopsis pilosula）8个品系和2个主栽品种的遗传多样性和亲缘关系。结果显示,14条引物共扩增出159个位点,其中多态位点26个,多态性位点比率为46.43%,材料间遗传相似系数范围在0.771 9～0.964 9,说明甘肃省主栽党参品种资源具有较丰富的遗传多样性。根据聚类分析结果,党参品种DS6与所有其他供试材料的亲缘关系最远,可单独聚为一类;DS3与DS8的亲缘关系最近,其相似系数为0.964 9。