多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

大口径毛细管气相色谱法测定三唑酮原药

[目的]建立以邻苯二甲酸二戊酯为内标物,用大口径毛细管气相色谱测定三唑酮原药的方法。[方法]以自制的大口径SE-30毛细管柱分离,火焰离子化检测器测定。用保留时间定性,内标法定量。[结果]结果表明,在所选择的色谱条件下,三唑酮和内标物在10min内很好地分离;三唑酮与内标物质量浓度比与它们的峰面积比有良好的线性关系,相关系数为0.999 9;样品加标回收率为99.7%~100.4%,相对标准偏差为0.053%。[结论]该方法操作简便、快速、准确,适合在工厂推广。     

植物甾醇高效液相色谱法正相和反相检测方法对比

分别使用正相柱和反相柱,采用高效液相色谱-紫外检测器(high performance liquid chromatography-ultraviolet detector,HPLC-UV)法测定植物甾醇,比较2种色谱柱法对植物甾醇检测的优缺点.正相色谱条件为:以Hypersil SiO2(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,流动相为V(正己烷)∶V(异丙醇)=99∶1,柱温35℃,流速1.0mL/min,检测波长205nm;反相色谱条件为:以默克RP-18(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,流动相为纯甲醇,柱温35℃,流速1.0mL/min,检测波长205nm.结果表明:混合甾醇在反相柱分离下出现3个峰,各种甾醇的分离度好;正相柱的甾醇只有1个峰,但样品在正相体系中的溶解性高于反相体系,而且正相体系甾醇出峰时间比反相体系快,可节约实验时间.说明在不要求各种甾醇分离效果的前提下,正相柱更适合用于植物甾醇检测.     

内标校准液相色谱荧光法测定食用油中苯并(a)芘

采用内标苯并（b）屈校正,建立了正相固相净化－反相液相色谱－荧光分光光度法测定食用油中苯并(a)芘的方法。正相Plus Silica固相萃取柱作为净化柱,反相C18柱作为分离柱。以苯并（b）屈作为内标,测定了苯并(a)芘的校正因子。使用本方法,苯并(a)芘在液态食用油和固态食用油中的检出限分别为0.01和0.03μg/kg。苯并(a)芘在不同食用油回收率在83%～108%之间,方法的日内精密度和日间精密度分别小于7.7%和13.2%。     

蜂王浆中氯霉素残留量的LC-MS/MS与ELISA检测方法研究

介绍了利用LC-MS/MS与ELISA方法快速、准确地测定蜂王浆中氯霉素残留量.前处理方法包括用酸沉淀蛋白、乙酸乙酯提取、自制硅胶柱、Oasis(HLB)小柱等净化步骤.同时,在LC-MS/MS测定方法中使用了同位素内标氯霉素-d5.建立的LC-MS/MS方法,多反应监测了氯霉素3对离子(321.0/256.9、321.0/194.0、321.0/175.8)和同位素内标氯霉素-d5 1对离子(326.0/157.1),检测低限为0.2μg/kg,线性范围为0.2～0.8μg/kg,加标回收率为97%～102%,RSD为1.9%～7.1%;ELISA方法检测低限为0.1μg/kg,该水平添加回收率为108.2%,RSD为12.2%.     

不同解离方法对莱克多巴胺猪尿阳性样品的提取效果研究

采用同位素内标法和高效液相-串联质谱法对猪尿莱克多巴胺阳性样品进行三种不同解离处理方法比较试验。结果表明,三种方法差异明显,β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶在37℃酶解16 h效果最好,在60℃酶解2 h效果次之,0.1%高氯酸酸解提取效果最差。     

液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A

建立了一种超高效液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A的方法。猪尿样品以莱克多巴胺—D3为内标,尿液经酶解提取后经MCX固相萃取柱净化,超高效液相色谱—串联质谱法测定。苯乙醇胺A监测离子为m/z344.7>149.5和m/z344.7>326.7。结果表明在1~100ng/mL范围内苯乙醇胺A呈良好的线性关系,高中低浓度相对回收率在98.8%~118.0%,变异系数小于10%,定量限为0.2ng/mL。该方法用同位素内标法定量准确,适用于猪尿中苯乙醇胺A的残留测定。     

气相色谱法测定注射用头孢美唑钠中残留溶剂含量

目的:采用气相色谱法同时测定注射用头孢美唑钠中有机溶剂丙酮、异丙醇、甲基异丁基酮残留量的方法。方法:采用内标法顶空自动进样,在中极性弹性毛细管柱上进行分离,效果良好。结论:方法重现性好,定量准确,便于操作。结果:平均回收率:丙酮100.7%-104.3%;异丙醇95.8%-103.7%;甲基异丁基酮102.9%-104.3%变异系数:丙酮1.71%异丙醇2.49%甲基异丁基酮3.55%。     

同位素内标GC/MS法测定猪尿和猪肝中克伦特罗

建立了同位素内标法定量测定猪尿和猪肝中克伦特罗的方法。猪尿和猪肝用乙酸乙酯、盐酸溶液提取，再经SCX固相萃取柱净化、N，O-双三甲基硅基-三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，定容后用气相色谱-质谱（GC／MS）测定，并以D9一克伦特罗为内标定量。猪尿和猪肝中克伦特罗的检出限分别为0．3ng／mL和0．3ng／g，克伦特罗的测定在5．0～400ng／mL范围内具有良好的线性关系，猪尿和猪肝中的平均回收率分别为100．3％和97．2％，批内变异系数分别为2．1％～4．8％，3．4％～6．4％，批间变异系数分别为2．5％～5．1％，2．7％～6．0％。通过与外标法比较，该方法定量准确可靠，更加适宜用作猪尿和猪肝中克伦特罗的定量测定。     

基于激光诱导击穿光谱的土壤钾素检测

为满足大田土壤钾素养分在线检测的迫切需要,设计了一种基于激光诱导击穿光谱原理的土壤养分在线检测的系统平台装置,并开展了土壤养分快速测定的实验研究,对采用激光诱导击穿光谱定量分析土壤钾素养分含量的可行性与准确度进行了探索。实验表明,土壤钾元素的特征谱线在波长766.49 nm和769.90 nm处,钾素养分含量与特征谱线强度呈正相关,但当钾素质量分数大于0.3%时,存在明显自吸收现象,谱线强度与样本质量分数呈非线性关系。为了消除土壤光谱检测的基体效应,选定土壤样本锂元素为内标元素,对土壤钾元素等离子光谱特征谱线进行内标校正处理。利用土壤样本钾元素的敏感特征波长766.49 nm和769.90 nm处的光谱强度对土壤钾元素含量进行二元线性建模分析,建模曲线拟合效果良好,模型决定系数达到0.933 7,相对均方根误差仅为0.276 1。利用该实验系统,土壤钾素养分最低检测限为212μg/g,初步具备土壤钾素养分在线检测的要求。