猪圆环病毒3型Rep蛋白的表达与多克隆抗体制备

为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,Rep在大肠杆菌中获得大量表达,且主要以包涵体形式存在,重组蛋白相对分子质量约为32 000,经纯化后得到单一条带。表达的重组Rep蛋白可以与PCV3阳性血清发生反应。制备的大鼠抗Rep血清与表达的重组Rep蛋白发生特异性反应,且效价大于1∶32 000。表明本试验表达的Rep具有良好的免疫原性和反应原性,为PCV3的ELISA诊断试剂盒研制提供依据。     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)氨基肽酶基因克隆、表达及重组蛋白活性分析

通过RT—PCR扩增出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）氨基肽酶基因，并对该基因进行克隆、鉴定及序列测定。捻转血矛线虫氨基肽酶ORF由2919个碱基（972个氨基酸）构成，和GenBank中的捻转血矛线虫氨基肤酶（H11抗原）同源性高达98％。与秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）肽酶M1家族同源性为61％，且具有氨基肽酶特征性基序HEXXH和GAMEN。将该基因亚克隆到原核表达栽体并进行了表达，通过测定重组蛋白分解氨基肽酶底物的能力以及对酶抑制荆敏感性试验，进一步证实了H11抗原具有一定的酶活性。     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。     

猪囊尾蚴头节单链抗体-PE40重组蛋白的表达及抗虫活性分析

将含有抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因（ScFv）和绿脓杆菌外毒素基因（PE40）的重组质粒pET28．ScFv-PE40转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,表达产物通过SDS-PAGE和westernblot鉴定,其表达蛋白的相对分子量约为68ku,表达量约占菌体总蛋白的13．8％。将融合蛋白通过金属Ni2^＋亲和层析柱纯化后,目的蛋白纯度在95％以上,可溶性蛋白的回收率约为50％,回收量为5mg／L。本研究所进行的纯化重组蛋白的体外杀伤六钧蚴试验表明,重组蛋白对六钩蚴具有较强的杀灭作用,而且与其剂量呈正相关性。     

从发病仔猪呼吸道检测出猪腺病毒

根据猪腺病毒六邻体保守区域设计两对引物,用Nested-PCR的方法从送检的发病仔猪的呼吸道分泌物中扩增出两个核酸片段.通过基因克隆、序列测定和序列比较,发现这两个核酸片段与猪腺病毒5型和3型的相应片段同源性最高,分别为97.4%和95.3%.证实发病仔猪呼吸道存在猪腺病毒的感染.为下一步猪腺病毒的分离及猪腺病毒表达载体的构建打下基础.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测

经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

日本脑炎病毒囊膜蛋白的基因原核表达及抗原性分析

参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。     

鸡大肠杆菌iss基因的克隆测序及原核表达

本实验对鸡大肠杆菌O2血清型菌株进行iss基因克隆测序，并在此基础上设计出两对套式引物，分别对含信号肽Miss基因序列和不含信号肽Miss基因序列进行扩增，并与原核表达载体pGEX-6p-1连接进行原核表达。iss基因克隆测序的结果与两组国外发表Miss基因序列进行比对，其同源性达100％。SDS—PAGE鉴定显示融合蛋白获得了较理想的表达，融合蛋白分子量分别约为36kD和33kD。     

小反刍兽疫病毒H蛋白原核表达的研究

小反刍兽疫病毒属副粘病毒科麻疹病毒属,为一不分节段的负链RNA病毒。本研究以灭活的检测用抗原为材料,抽提基因组RNA作为模板,根据GenBank下栽的序列及载体的需要设计其主要的抗原基因H基因的编码序列的RT—PCIL扩增引物;然后将扩增基因片段与T载体连接克隆测序,再与原核表达载体pET100／D—TOPO连接、诱导表达。结果显示所设计引物对模极有预期扩增,序列测定表明为正确片段;片段经纯化与表达载体连接,已挑到阳性克隆。H基因的表达菌经IPTG诱导,SDS—PAGE电泳。结果显示：H基因有预期分子量大小的蛋白表达;用Anti—His抗体已检测到相应融合蛋白的表达,其原核表达的相应蛋白抗原性状况正在试验研究中,表达产物具有潜在的诊断抗原和免疫原价值。