Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater

ABSTRACT:   The toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense (Lebour) Balech and A. catenella (Whedon and Kofoid) Balech produce potent neurotoxins, such as saxitoxin and gonyautoxin and have been mainly responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP) in Japan. To prevent a negative effect on the fishery industry, it is necessary to identify these toxic species precisely and rapidly before and during the bloom. In this paper, a rapid and simple protocol of a fluorescence in situ hybridization (FISH) method using ribosomal RNA (rRNA)-targeted probes has been established for identifying the cultured strains and natural cells of A. tamarense and A. catenella . Using the FISH method established in this study, it was possible to identify these toxic species species-specifically and rapidly, within 30 min. The procedure of detection constituted three steps: (i) fixation/dehydration; (ii) hybridization; and (iii) washing; this made the identification simple. Moreover, this method did not require either special techniques or equipment, and the cost for detection was low. The specificity, rapidity, and simplicity of the developed method suggest that it might be useful for routine monitoring of these toxic microalgae.     

星斑川鲽MHCⅡ恒定链Ii基因的克隆和表达特性

为了研究星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用及调控机制,实验通过SMART-RACE技术克隆得到了星斑川鲽MHCⅡ恒定链(MHCⅡIi)的全长cDNA序列,其长度为1766 bp,包含135 bp的5′非编码区、837 bp的开放阅读框和794 bp的3′非编码区。该基因共编码279个氨基酸。理论分子量为30.848 ku,等电点为6.89。与已知物种MHCⅡIi进行同源性比对,结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近,同源性均为79%。利用quantitative realtime PCR(qRT-PCR)技术检测了MHCⅡIi在星斑川鲽不同组织中的表达,以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的影响,结果显示:在脾脏、头肾、肝脏、后肠、性腺、心脏、血液、鳃和肌肉组织中,MHCⅡIi mRNA均有表达,但在表达量上有明显差异,脾脏和头肾组织相对表达水平较高,鳃、血液、肌肉、心脏和性腺中的表达水平较低。病原感染后,免疫相关组织脾脏和头肾的表达水平升高最明显,肝脏和后肠的表达水平也略有升高,但变化不明显。本研究可为星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用机理提供理论依据,同时为海水养殖鱼类的抗病遗传育种工作提供研究基础。     

基于iTRAQ质谱分析技术筛选南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白

为了从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)适应盐胁迫的分子机制,本研究以30 d苗龄的南方型紫花苜蓿实生苗为材料,分析正常培养和250 mmol/L NaCl处理72 h后根中的蛋白表达变化,采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能耐盐潜在靶标蛋白.同时,选择5个差异表达蛋白进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.结果表明,共鉴定3 857种定量蛋白,534种差异蛋白(变化倍数≥1.2,P＜0.05),其中表达上调的281种,表达下调的253种.基因本体(Gene Ontology,GO)分子功能提示这些差异性蛋白主要参与转运活性、催化活性和酶调控活性.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、苯丙氨酸代谢和核糖体等(P＜ 0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)＜ 0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到信号传递(8.99％)、抗氧化物(7.68％)、防御(5.61％)、蛋白质合成、加工和降解(14.79％)、能量产生与转运(5.81％)、代谢(26.97％)、膜与胞内运输(5.62％)和细胞结构、分裂和细胞骨架(2.06％)等.差异表达蛋白中与信号传递、抗氧化物和防御等相关的蛋白表达量总体上调,而与代谢和能量产生与转运相关蛋白表达量总体下调.qRT-PCR实验发现,mRNA与蛋白质表达水平并不一致.研究发现组氨酸磷酸转移蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、h类硫氧还蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶基因、鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)解离抑制因子、脂质转移蛋白、β-1,2-木糖基转移酶和H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.本研究采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,有效地筛选出南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础.     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

浙江省严重干旱发生年份的GM（1，1）预测模型

传统灰色GM（1，1）模型对稳定序列的中长期预测效果较好，对变化幅度较大的严重干旱年序列的中长期预测效果较差。本文采用中心逼近式灰色GM（1，1）模型，通过调整m值，使模型精度达到要求，从而建立浙江省严重干旱发生年份的GM（1，1）预测模型。拟合结果表明，该方法对预测浙江省下一个严重干旱发生年有一定的参考价值。     

番茄育种种质对南方根结线虫抗性评价及Mi-1基因检测

本研究以自育的26份番茄育种种质和抗南方根结线虫番茄品种‘仙客1号’及感南方根结线虫品种‘阿乃兹’为试验材料,采用病土盘栽自然发病鉴定、苗期二龄幼虫人工接种鉴定和PCR扩增及CAPS检测相结合的方法,研究供试材料对南方根结线虫的抗性水平及基因型。鉴定结果表明,供试的28份番茄材料中,高抗17份、抗病6份(包括抗病对照‘仙客1号’)、感病2份、高感3份(包括感病对照‘阿乃兹’),无免疫材料,且病土盘栽鉴定与苗期接种鉴定的结果一致。PCR扩增结果表明,27份番茄材料均能检测到一条750 bp的特异条带;TaqⅠ酶切结果显示,具有酶切位点的22份试材中有15份含纯合显性Mi-1/Mi-1基因、5份含杂合显性Mi-1/mi-1基因、2份含180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段,并且这22份试材对南方根结线虫表现高抗或抗,而其余5份不含显性Mi-1基因的试材则表现高感或感,证明Mi-1是具有抗南方根结线虫能力的基因,分子检测结果与病土盘栽鉴定和苗期接种鉴定的结果吻合率达92.6%;含有180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段的高抗材料可能含有其它抗根结线虫基因。分子检测与抗性鉴定相结合,能为创制抗南方根结线虫新种质提供一种更加省时、省力且经济有效的科学育种方法,可为番茄抗南方根结线虫育种提供理论依据和实践经验。     

不同保鲜剂对碧螺春茶保鲜效果的影响

以苏州碧螺春茶为试材,设计了16种不同保鲜剂,经过一定条件贮藏后,观察其对碧螺春茶的保鲜效果.结果表明,处理9(硅胶和抗坏血酸钠系列)与处理11(焦亚硫酸钠和抗坏血酸钠系列)保鲜效果最好,处理1(铁粉和氯化钠系列)、处理6(铁粉、氯化亚铁、碳酸氢钠、反丁烯二酸和沸石系列)、处理12(细孔硅胶)、处理14(活性干燥剂)保鲜效果较好.并对感观品质各特点与生化成分含量的相关性做了分析研究.     

短季棉主要农艺性状的遗传分析

选用5个早熟不早衰的短季棉品种和5 个早衰的短季棉品种进行部分双列杂交。通过对亲本、F1 和F2 代分别于2001 年和 2002 年两年田间试验研究。结果表明:子棉产量、皮棉产量和衣分3个性状以显性效应为主,其次为加性效应,同时还存在极显著的加性上位性与环境的互作效应,单铃重和成铃数以显性效应为主;与早熟有关的诸性状,生育期、始花期、铃期和果枝始节4个性状以加性效应为主,其次为显性效应,霜前花率以显性效应×环境互作效应为主,同时存在显著的加性上位效应,落叶株率以加性与加性互作上位性为主,落叶指数以加性效应为主;与纤维品质有关的诸性状,2.5%跨长、比强度、伸长率3个性状以加性效应为主,其次为显性效应,同时还存在着加性、上位性与环境的互作效应;同时还研究了产量、早熟性和纤维品质各性状之遗传和表型相关关系。     

烟草含钾量反射仪-钾离子试纸法快速测定研究初报

比较了反射仪—K 试纸法(K ts-fl)、原子吸收光谱法、ICP-aeS法测定烟株叶脉汁液中的K 含量的三种方法,确定反射仪—K 试纸法测定烟株钾含量的可行性及其最佳测定范围;在烤烟不同生育期,应用反射仪—K 试纸法对烟株叶片不同部位含K 水平的测定,确定其最佳测定时期及部位。研究结果表明,反射仪—K 试纸法与原子吸收光谱法、ICP-aeS法测定结果差异不显著,应用反射仪—K 试纸法进行烟株钾素快速诊断可行,且具有时间短,简单快速,易操作等优点。反射仪测定K 的稳定线性范围是0.30～0.9g/L;在不同时期对烟株不同部位测定研究表明,最佳诊断部位为烟株第二平展叶叶脉基部2cm段。     

新疆特早熟陆地棉纤维细胞发育过程的超微结构观察

 利用透射电镜观察新疆特早熟陆地棉新陆早36号纤维发育过程中的超微结构变化。在10 DPA纤维细胞初生壁形成期,液泡占据纤维细胞中央,细胞质中有大量的线粒体、内质网、高尔基体等细胞器,初生壁较薄且厚度均匀;在20 DPA时,纤维在初生壁内已明显有一层薄薄的次生壁的形成,细胞质中细胞器部分解体;随后次生壁增厚速度逐步加快,在30 DPA到40 DPA之间,纤维平均增厚速度约为每天0.139 m,在40 DPA到50 DPA之间,纤维平均增厚速度约为每天0.47 m。纤维细胞次生壁向内层逐步层层加厚,形成“日生长轮”。随着纤维细胞的脱水成熟,纤维细胞次生壁增厚使纤维中腔只剩下一条窄缝。观察结果表明,虽然特早熟陆地棉发育进程快,开花早,但纤维细胞的发育进程与所报道的其它棉花品种具有相似性。