普通小麦TaSEC14p-5基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白,含有一个典型的SEC14保守结构域.S0ec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中,并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动,但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道.为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能,本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因,命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号:KU639968).氨基酸序列分析表明,该基因ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,相对分子质量为37.1 kD,理论等电点为7.70.在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域.进化和聚类分析表明,小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为96.45％和88.38％.采用qRT-PCR技术,对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析.发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达,且在茎中表达量较高,雄蕊次之,根最低;该基因受高盐的强烈诱导,同时也受到脱落酸(abscisic acid,ABA) (200μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4℃)不同程度的胁迫诱导.TaSEC14p-5在NaC1、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下,总体趋势为先上升后下降.结果推测,TaSEC14p-5基因可能参与了NaC1、ABA、PEG6000和4℃等不同程度的非生物胁迫处理,为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据.     

番茄斑萎病毒4种检测方法比较

本研究根据番茄斑萎病毒(TSWV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因保守序列设计特异性引物,比较了4种检测方法的灵敏度。结果表明,特异性引物可扩增出397bp的片段,序列和已发表的TSWV核苷酸序列同源性高达99%,可用于常规PCR和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测。qRT-PCR的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和常规PCR分别高出15 625倍、3 125倍和125倍,且能够准确定量;常规PCR灵敏度较高,但不能准确定量;DAS-ELISA方法适用于批量定性测定,但检测时间较长;试纸条法检测速度最快,但灵敏度最低,使用时可根据症状程度和试验条件选择适宜的检测方法。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成.本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式.结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低.鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达.鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达.其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调.用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达.研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程.本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制.     

茶树低温胁迫下microRNA实时定量PCR内参基因的筛选

MicroRNA（miRNA）在基因的转录后调控上起到重要作用,对其表达水平的定量研究已成为一种常见实验,选择合适的内参基因是确保实时荧光定量PCR（qRT-PCR）准确性的先决条件。本研究以茶树为材料,挑选了9个候选内参基因,用qRT-PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用BestKeeper和geNorm软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,一种茶树新miRNA（PC-3p-222）在不同低温处理以及不同茶树组织中表达最为稳定,Ct平均值为22~23,丰度适中,可以作为茶树低温胁迫下miRNA qRT-PCR的内参基因,为miRNA定量研究工作提供参考。     

核桃Y2SK2型脱水素基因JrDHN的克隆、表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和RACE技术从‘香玲’核桃（Juglans regia L.‘Xiangling’）叶片中克隆了1个脱水素基因JrDHN（GenBank 登录号KC503061.1）,其全长1 056 bp,具有528 bp的开放阅读框,编码175个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列,属于典型的Y₂SK₂型脱水素。以核桃18S基因为内参,对‘香玲’核桃JrDHN在4 ℃胁迫下的表达模式进行了初步的研究,结果表明低温诱导下叶片中JrDHN的表达增加,4 ℃处理4 h后达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrDHN表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrDHN在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。‘香玲’JrDHN在雌花中表达量高,其次是叶片和树皮,在花芽中最低。单核苷酸多态性分析JrDHN序列中有30个SNPs位点和11个Indels;单倍型分析显示12份核桃材料可分为10个单倍型,单倍型多样性为0.9697。     

ATP合成相关基因在小麦BNS不育系育性转换中的差异表达

为了探讨ATP合酶α亚基和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)与温敏雄性不育系BNS育性的联系,利用荧光实时定量PCR方法,在花药发育的4个重要时期(四分体期、单核期、二核期和三核期),定量检测ATP合酶α亚基和APRT相关基因在不育及可育条件下花药中的mRNA表达水平。不育条件下,ATP合酶α亚基基因从四分体到二核期表达量持续下降,与可育株相比在单核期表达量显著下降;APRT1在4个时期的表达量低于其在相应可育条件下的表达量,而APRT2基因在BNS不育和可育条件下维持较低的表达水平。APRT相关基因表达量在三核期均有较显著提高,且可育条件下比不育条件下提高更明显。因此认为,ATP合酶α亚基基因与BNS育性转换密切正相关,APRT基因在三核期转录水平的变化与BNS育性转换有一定关系。     

MircoRNA156家族在小麦非生物胁迫中的表达分析

MircoRNA (miRNA)作为一类20碱基左右的非编码RNA,它在转录水平调控基因的表达,在植物抗逆境胁迫的调节网络中发挥了重要作用.通过对小麦miRNAs的研究,可以扩展小麦抵抗自然灾害的途径,减少损失.有报道表明miR156作为保守的miRNA在多种植物中参与到抗逆反应[1],Xin等[2]发现不同小麦品种的miR156在不同时间点分别受到白粉菌和热胁迫的诱导,尽管对miR156家族个别成员的研究已经有了相关报道,但对小麦miR156的整个家族的报道较少,对它们在小麦受到非生物胁迫网络中发挥的作用还不清楚.本研究拟明确小麦中miR156家族成员,并选取机械伤害、冷害和对植物损害较大的UV-B三种处理方法,探索miR156家族成员在不同的非生物胁迫中的作用.     

蝗虫节律基因pdp的克隆及功能分析

[目的]研究不同条件下蝗虫（Locusta migratoria）节律基因pdp（Pyruvate dehydrogenase phosphatase）的mRNA表达水平,进一步揭示蝗虫节律的分子机制。[方法]通过中国科学院动物研究所内的转录组数据库中找出pdp基因的原型来设计引物,以群居型东亚飞蝗的头部的反转录cDNA为模板,克隆出pdp基因的全序列。把一天24 h等分成8个点,进行定时取样,以qRT-PCR技术进行不同时段pdp基因表达量的测定;并在不同处理条件下。测定pdp基因的表达量。[结果]节律基因pdp在蝗虫的不同处理条件下变化不大。[结论]该研究对了解飞蝗节律规律、种群特点及有效防虫具有重要的现实意义。     

Inductive expression of the NOD1 signalling pathway in chickens infected with Salmonella pullorum

1. The aim of this study was to describe the role of Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1 (NOD1) receptor signalling in chicken.

2. Tissue-specific expression analysis of NOD1, receptor-interacting serine-threonine kinase 2 (RIPK2), nuclear factor kappa B (NF-κB) and mitogen-activated protein kinase 11 (MAPK11 or p38) by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) revealed their wide distribution in various organs and tissues.

3. Salmonella pullorum infection activated NOD1 receptor signalling in vivo and in vitro, resulting in significant induction of downstream signalling molecules RIPK2, NF-κB/p65, MAPK11/p38 and the effector molecules IL-1b and IL-8.

4. Activation of NOD1 by its agonist bacterial γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid (iE-DAP) in HD11 cells induced the adapter molecular RIPK2 and activated the NF-κB/p65 and MAPK11/p38 pathways, resulting in an increase in IL-8 but not IL-1β. Additionally, inhibition of NOD1 using NOD1-shRNA resulted in downregulation of RIPK2, MAPK11 and IL-8, while NF-κB/p65 and IL-1β were unaltered.

5. These results highlight the important role of NOD1 receptors in eliciting the innate immune response following pathogenic invasion in chicken.