小麦钙调素新亚型TaCaM5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术,从条锈菌诱导的小麦叶片中分离出一个编码CaM基因的cDNA序列, 经氨基酸序列分析确定其为一个新的小麦CaM亚型,暂被命名为TaCaM5。TaCaM5包含一个完整450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸;编码的蛋白不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,具有4个EF-hand保守结构域。在目前已知的CaM基因中,TaCaM5与玉米CaM基因的亲缘关系最近,相似性高达97%。该基因在根、茎、叶等组织中均有不同程度的表达;并且受条锈菌诱导表达,在非亲和组合与亲和组合中,分别在接种后6 h和24 h表达量最高。外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯诱导TaCaM5上调表达,水杨酸诱导其下调表达。TaCaM5在机械伤害、干旱和低温条件下表达量上升,在高盐环境下表达量降低。表明TaCaM5可能通过茉莉酸和乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与机械伤害、低温和干旱环境下的Ca²⁺-CaM信号转导途径。     

小麦条锈菌III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1）的功能分析

【目的】克隆小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1）,分析其在小麦条锈菌生长发育与致病过程中的作用。【方法】利用RT-PCR技术克隆PsPik1的cDNA序列,采用生物信息学技术分析该基因编码蛋白分子特征并构建进化树;运用实时荧光定量PCR技术,选用小麦条锈菌的延伸因子（elongation factor,EF）作为内参,明确该基因在小麦条锈菌夏孢子阶段和侵染小麦后6、12、18、24、36、48 h以及3、5、7、9、11 d共12个发育时期的表达特征;利用病毒介导的基因沉默技术（BSMV-host-induced gene silencing,BSMV-HIGS）,分析沉默PsPik1后对小麦条锈菌生长发育及致病性的影响。通过传统酶切连接的方法构建重组载体BSMV:γ:PsPik1-as,利用体外转录技术获得BSMV α、β与γ3个组分,在小麦二叶一心期接种BSMV: γ:PsPik1-as、BSMV: γ:0-as与BSMV: γ:TaPDS-as。接种病毒后第10天,在小麦第4叶接种条锈菌CYR32,接菌后24、48、120 h分别取样,以检测PsPik1的沉默效率和进行组织学观察。样品经染色处理后,统计分析接菌后48 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌丝分支数、吸器母细胞数与菌丝长度的差异,及120 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌落面积的差异。在接菌后12 d观察条锈病发病情况并照相记录。【结果】PsPik1开放阅读框（open reading frame,ORF）全长4 485 bp,编码1 494个氨基酸,具有III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶典型的脂激酶特有结构域（LKU）、钙神经传感蛋白（NCS1）结合位点、Hom2结构域和PI3K/PI4K超家族激酶结构域。聚类分析表明,PsPik1聚于PI4KIIIβ类群,PsPik1与柄锈菌属的Pik1亲缘关系较近,与子囊菌Pik1亲缘关系次之,而与动物及植物的PI4KIIIβ亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,PsPik1在接种后6、12、18、24 h呈诱导上调表达趋势,分别为夏孢子时期表达量的2.66、7.04、3.42、2.96倍,其中在12 h其表达水平最高。接种后36 h至5 d,PsPik1的表达水平开始下降,一直低于夏孢子表达水平,分别为夏孢子表达量的60%、30%、16%、15%。接种后7-11 d,PsPik1的表达量开始升高,在接种后11 d恢复至与夏孢子相当的水平。PsPik1基因沉默后的组织学观察分析表明,与接种BSMV:γ:0-as（对照）相比,接种BSMV:γ:PsPik1-as植株中条锈菌组织分化与生长发育受到了不同程度的影响,表现在接菌后48 h菌丝长度和分支数目明显减小,接菌后120 h菌落面积明显减小。沉默效率检测结果显示,在接菌后24、48、120 h,接种BSMV:γ:PsPik1-as植株PsPik1的表达水平分别仅为对照植物的49%、49%、69%,表明PsPik1的表达明显地受到抑制。【结论】PsPik1可能参与了病菌侵染初期的侵染结构分化及寄生关系的建立,在条锈菌致病过程中发挥重要作用。     

溃疡病不同抗性杨树SA和JA信号转导相关基因的差异表达分析

为了探讨抗、感病杨树品种受欧美杨细菌性溃疡病菌(Lonsdalea quercina subsp. Populi)诱导后植物激素相关基因的差异表达规律,为阐明杨树抵抗溃疡病菌的防卫反应机制提供试验依据。筛选了12SA和JA信号转导的相关基因,利用实时定量PCR技术分析了抗病树种‘毛白杨’(Populus tomentosa)和感病树种‘中菏1 号’(P. deltoids cv.‘Zhonghe 1’)在接种溃疡病菌后不同时间段（1、3、6、9 天）各基因的表达动态差异。结果显示,在溃疡病菌胁迫下,基因PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2、TGA1、TGA2、MYC2-1、MYC2-2 在抗病品种中有更高的表达量,尤其是基因PR1-1、MYC2-1、MYC2-2;基因JAZ1、COI1-1、COI1-2 在抗、感品种接种溃疡病菌后的前期皆为普遍下调表达,但在抗病品种中表达量更低;基因JAZ2 在抗、感品种中的表达量变化不大。该研究初步表明,抗病品种‘毛白杨’对溃疡病的抗性是溃疡病菌诱导了基因PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2、TGA1、TGA2、MYC2-1、MYC2-2 的上调表达以及基因JAZ1、COI1-1、COI1-2的下调表达,开启了SA和JA信号转导通路的结果。     

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。     

Identification of Genes Encoding Secretory Proteins Related to the Pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum Using TRV-HIGS

【Objective】 Sclerotinia stem rot (SSR) caused by Sclerotinia sclerotiorum is the main problem in rapeseed planting in China, which causes serious yield and quality loss. Secretory proteins play an important role in the pathogenesis of pathogens. The genome of S. sclerotiorum contains a large number of genes encoding secretory proteins. The objective of this study is to identify and screen the secretory protein genes related to pathogenicity, reveal the pathogenic mechanism of S. sclerotiorum, and to provide an important target for the prevention and control of SSR. 【Method】 SMART software was used to analyze the protein domains of 8 candidate genes with signal peptides that were differentially expressed in the process of S. sclerotiorum infecting the susceptible and resistant Brassica oleracea lines, then the domains obtained by SMART analysis were annotated in SCOP, Pfam and PDB databases. The fragment with the length of around 300 bp in the encoding region of these genes was cloned into pTRV2 vector together with the GFP fragment. The suspension of pTRV1 was mixed equally with pTRV2-Gene and pTRV2-GFP, respectively. After 3 hours at room temperature, pTRV2-Gene vector and control (pTRV2-GFP) were transformed into 5-6 week-old leaves of Nicotiana benthamiana using syringe infiltration method. Subsequently, the infiltrated plants were cultured in dark for 48 hours and then grown in the normal light for 7 days. PDA mycelium blocks of S. sclerotiorum with a diameter of 6 mm were used to inoculate the infiltrated leaves of tobacco at the 9th day after transformation in vivo, in which the carrying surface was close to the leaves. After 48 hours of inoculation, the lesion size was measured and RNA from necrotic and infected tissues (around 1 cm from the edge of necrotic tissue) was extracted. qRT-PCR analysis was carried out to estimate the relative expression of target gene in N. benthamiana lines carrying TRV-HIGS vector. 【Result】 The putative functions of these 8 genes predicated with SMART and domain annotation were involved in the hydrolysis of proteins, nucleic acids or polysaccharides, the immunity response of host plants, and the tolerance to drugs and biotin synthesis of S. sclerotiorum. The average lesion area of control carrying TRV-GFP was 3.44 cm ² at 48 hours post inoculation of S. sclerotiorum. Except for one line (SS1G_07655), the lesion area of other 7 lines carrying TRV-HIGS vector was significantly lower than that of the control plants (P≤0.05), ranging from 1.63 to 2.61 cm ². qRT-PCR analysis showed that the gene expression level of these 7 genes in the TRV-HIGS lines was significantly lower than that of the control (P≤0.05). 【Conclusion】 Eight secretory protein genes with unknown function in S. sclerotiorum were successfully identified by TRV-HIGS technique. Seven genes related to the pathogenicity of S. sclerotiorum were screened out. Among them, SS1G_03146 with the strongest effect on the pathogenicity of S. sclerotiorum may be involved in the synthesis of biotin, and SS1G_04343 and SS1G_11912 may be involved in the immune response of host.     

膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达.对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高.HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控.对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达.本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.     

碱胁迫下脱落酸对两种苹果砧木幼苗根系生长的影响

土壤是制约苹果根系生长的主要因素。为了进一步分析苹果砧木根系对碱胁迫的响应,首先对两种耐碱性不同的苹果砧木幼苗——富平楸子（Malus prunifolia）（耐碱性强）与平邑甜茶（M. hupehensis）（耐碱性较弱）的根系结构和脱落酸（ABA）含量进行了分析。之后,又对富平楸子进行了转录组分析。在碱胁迫15 d后,和富平楸子相比,平邑甜茶幼苗的根系生长明显降低。两种砧木幼苗根系中脱落酸（ABA）含量均在48 h增加,但平邑甜茶根系中ABA含量的增加幅度较小。qRT-PCR分析结果显示,在富平楸子中,CIPK1和AHK1表达量在24 h和48 h上调。而在平邑甜茶中,AHK1表达量在48 h有缓慢的上升,CIPK1的表达量下调。这些结果表明,碱胁迫下,ABA含量的增加可能促进根系的生长,提高植物耐碱性。     

4种非洲猪瘟核酸检测试剂盒性能比较分析

目的：为猪场实验室提供科学的非洲猪瘟病毒核酸诊断试剂盒选择方案。方法：选择4种非洲猪瘟核酸检测试剂盒,通过对比梯度稀释后标准物质的线性扩增、对低含量时（20 copies/μL）的敏感性、对以纯水为样本时假阳性检出率。结果：线性扩增试验中,A试剂盒对20 copies/μL浓度的标准品检测率为100%（3/3）,其他试剂盒对该浓度下的标准品,均未达到100%;低含量敏感性试验中,A试剂盒阳性检出率为91.67%（44/48）,其他厂家试剂盒的检出率分别为85.42%（41/48）、79.17%（38/48）、58.33%（28/48）;假阳性试验中,A和B未出现阳性反应,而C、D试剂盒分别出现2、1个非特异性反应。结论：经过性能比较,A试剂盒更符合猪场实验室对于高敏感性和低假阳性的要求。     

茄匍柄霉菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了准确检测病残体内茄匍柄霉菌(Stemphylium solani)DNA含量在土壤内的动态变化,本研究根据三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列,设计并筛选特异性引物Stem-g7F/Stem-g7R,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为150 bp的目的片段.建立的Stemphylium solani实时荧...