漆树酶的固定化——Ⅱ对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂固定化漆树酶的研究

漆树酶(EC.1.10.3.2)共价偶联在对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂上。研究了固定漆树酶的条件,比较了琼脂与琼脂糖两种固定化酶载体。固定化漆树酶的活力达23光密度变化值/分·克(干),活力回收达37％。找出了固定化漆树酶的最适温度和最适pH,测定了它的米氏常数,热稳定性和重复使用性,并且与天然漆树酶进行了比较。探讨了残余重氮盐对固定化酶的影响。固定化漆树酶能重复使用二十次以上,其热稳定性也优于天然漆树酶。     

漆酶活化产生的活性氧类自由基与竹粉板性能的关系

为研究漆酶处理毛竹材制板过程中产生的活性氧类（ROS）自由基相对浓度对竹粉板性能的影响规律,该文以酶用量、反应体系pH值、处理时间、处理温度及Cu2+浓度作为酶处理因子,在不同的酶处理条件下对竹粉进行漆酶活化处理,并于每种处理条件下分别进行自由基相对浓度的检测和竹粉板制板试验。结果表明:①板材的内结合强度（IB）、静曲强度（MOR）、吸水厚度膨胀率（TS）等物理力学性能都与漆酶处理毛竹材产生的ROS自由基相对浓度关系密切。②ROS自由基相对浓度与板材的IB、MOR均呈对数函数关系,而与TS呈双曲线函数关系,其相关系数均在0.93以上。      

真菌漆酶酶促合成茶黄素工艺的研究

采用漆酶体外酶促氧化茶多酚合成茶黄素。研究结果表明,在实验反应体系中,酶促氧化的最佳条件为:反应温度50℃,最佳pH值2.3,漆酶质量浓度1.8g/L,反应时间1.5h。其中pH值和温度是反应体系中2个极其重要的影响因素。与传统合成方法相比,该方法可以缩短反应时间,提高茶黄素产量。     

漆酶的生产和应用研究进展

综述了漆酶的性质、发酵法生产、分离纯化及其在工业和生物技术领域的应用。指出了漆酶在理论研究、工业化生产和应用领域存在的问题及其发展前景。     

优化培养条件对提高香菇漆酶产量的研究

对香菇发酵产漆酶条件进行了优化并研究了部分漆酶性质。结果发现静置培养优于振荡培养;pH值≥5.6时香菇菌体基本无法生长,香菇最适生长及产酶pH值为3.5;20℃低温有利于香菇漆酶生长,但最适产酶温度是25℃;Cu2 浓度为0.2~1.0 mmol/L时有利于香菇漆酶的合成,其中0.4 mmol/L是香菇产漆酶的最佳铜离子浓度,当铜离子终浓度超过5 mmol/L时,严重抑制香菇菌丝的生长;除了2,5-二甲基苯胺之外,阿魏酸、愈创木酚、没食子酸、黎芦醇等诱导剂促进香菇合成漆酶的作用不明显,反而会抑制菌丝生长;Tween-80的加入不利于漆酶合成。香菇漆酶在60℃条件下保温1 h后仍残余了2%的活力;以2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物的最佳反应温度是65℃,最适反应pH值为2.2(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系)。     

三色革裥菌胞外漆酶纯化及部分动力学性质测定

采用两种不同的介质组合对三色革裥菌(Lenzites tricolor)胞外漆酶进行分离纯化,第一种组合方式为:(NH4)2SO4盐析,透析,聚乙二醇(PEG20000)浓缩,SephadexG-150柱层析(1.6cm×60cm),DEAE-Sepha-dexA-25离子交换层析(2.6cm×40cm);第二种组合方式为:(NH4)2SO4盐析、透析、超滤浓缩、DEAE-Sepha-roseFF离子交换层析(1.6cm×60cm)、SephadexG-75凝胶层析(1.6cm×60cm)。测定结果表明,第二种组合方式较高效、合理。该漆酶反应活力最高时温度为60℃、最适pH值为4.6。所测试浓度下,Fe2 、Fe3 、硫脲、叠氮化钠和二硫苏糖醇对漆酶活性有一定抑制作用;Ca2 、乙二氨四乙酸及其二钠盐对漆酶活性具明显的促进作用。氧化丁香醛连氮的米氏常数Km值为43.4μmol/L。     

毛竹漆酶基因启动子序列分析及基因表达模式

漆酶在细胞壁形成、逆境胁迫、花青素形成和酚类物质催化等过程中均发挥着重要作用，其基因表达受到多种外界因素的影响。为揭示竹子中漆酶基因的表达模式，以毛竹（Phyllostachys edulis）为对象，利用生物信息学手段分析了其中42个漆酶基因（PeLACs）启动子序列，利用已有的转录组数据分析了其中PeLACs的表达模式，克隆漆酶基因PeLAC20的启动子序列PeLACp，并构建了瞬时表达载体，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中瞬时表达。结果表明，在42个PeLACs启动子序列中包含多种与激素以及非生物胁迫相关的顺式作用元件，在GA₃处理以及低温和干旱胁迫下各基因表现为不同的表达模式，表明它们参与激素和非生物胁迫的应答，而且功能存在着一定的差异。PeLACs在毛竹不同生长阶段根和笋中的表达模式也证明了各基因功能的差异性。克隆的PeLACp序列为2 000 bp，利用GUS染色法检测启动子PeLACp的活性显示，PeLACp主要在转基因拟南芥的根中表达。研究结果为进一步揭示毛竹漆酶基因的生物学功能提供了参考依据。     

杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.      

不同白腐真菌复配对底物碳和氮的利用规律的研究

通过单一白腐真菌和不同白腐真菌复配对底物碳、氮消耗的比较,得出随着碳、氮的消耗,无论是单一菌还是复合菌,酶活峰值均发生在对数消耗阶段;并且缓慢消耗阶段越长,产酶量越低;在产酶最高的青顶拟多孔菌的参与下,对底物碳氮的利用显著,同时提高产酶量,缩短达到酶活峰值所用时间;在不产酶菌株的参与下,延长对底物碳氮的吸收时间和达到酶活峰值所用时间,对产酶量的影响较小。