流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。     

酸铝胁迫下4个速生桉优良无性系的生长反应

采用砂土培育法研究不同的酸铝处理对几种桉树优良无性系（巨尾桉9号、巨尾桉12号、尾叶桉4号、韦赤桉3号）幼苗生长及膜透性等变化的影响。试验设: pH 3.0＋0 mg/L Al3+、 pH 3.0＋120 mg/L Al3+、 pH 4.0＋0 mg/L Al3+、 pH 4.0＋120 mg/L Al3+、 pH 4.8＋0 mg/L Al3+5个处理。结果表明,不同酸铝处理对4个桉树优良无性系形态、生长指标、含水率、叶绿素含量、质膜透性和脯氨酸含量等都产生不同的影响。与对照（pH 4.8＋0 mg/L Al3+）相比,pH 3.0＋120 mg/L Al3+处理对桉树幼苗的生长产生的抑制作用明显,叶、芽皱缩、变形,苗高、地径以及各器官含水率降低,质膜透性和叶绿素含量下降,桉树幼苗累积较多的脯氨酸。其中,巨尾桉广林9号对酸铝逆境的抗性优于其它3个无性系。4个桉树优良无性系抗酸铝逆境的能力强弱依次为: 巨尾桉9号巨尾桉12号 韦赤桉3号尾叶桉4号。因此,选育耐酸铝桉树无性系品系是改善南方富铝化酸性土壤林地生产力的重要策略之一。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT—PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%~96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%~98.3%之间。     

水稻体细胞无性系变异的研究

分析了通35、延农糯2号、低amylose突变体、陆奥誉、秋光等5个水稻品种（系）体细胞无性系后代的性状变异．结果表明：水稻体细胞无性系有植株变矮、分蘖增加、每穗总粒数和实粒数减少、结实率和单穗重降低的趋势，株系之间差异很大，其具体表现因品种（系）而不同．在苗期出现白化苗、浅绿苗的分离。体细胞无性系的结实率和花粉可育率呈极显著正相关．体细胞无性系后代的减数分裂期观察到染色体桥、染色体断片、落后染色体及单价体等染色体结构变异．     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

应用RACE法分离和克隆猪GPX2基因研究（英文）

[Objective] Using molecular biotechnology to clone the sus scrofa GPX2 gene.[Method] Using total RNA of sus scrofa duodenum as template,degenerated primer pairs were designed according to the homology alignment analysis of GPX2 gene of human,rat,mouse,dog and cattle.A sus scrofa GPX2 gene sequence of 330 bp was obtained by RT-PCR application method.Primes were designed respectively according to the known sequence,sus scrofa GPX2 gene was isolated and cloned by 3-RACE and 5-RACE method and analyzed the gene sequence.[Result] A mRNA sequence of 924 bp was successfully cloned and isolated in this research.This sequence contained complete 3' end and had higher sequence homology with human,mouse,cattle and dog GPX2 gene,and there was codon called TGA which encoding Sec on the position of No.114-116 gene.[Conclusion] Sequence alignment analysis showed that the cloned gene was sus scrofa GPX2 gene(NCBI GenBank database,the sequence number was DQ98982).     

擎天凤梨GAPDH基因的克隆及序列分析

管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得GAPDH基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个GAPDH的全长cDNA序列,序列长1 790 bp,编码421个蛋白氨基酸,命名为GoGAPDH1。采用Blast,ExPASy,ProtParam,SPOMA,Find Conserved Domains(NCBI),ClustalX, MEGA等生物信息学软件对cDNA 序列、氨基酸序列、保守区、亲缘关系等特征进行分析。结果表明,GoGAPDH1与玉米的细胞质GAPDH基因源性最高,为82%。初步推断GoGAPDH1可能是一个胞质型GAPDH。     

新疆奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌FnbpA基因的克隆与序列分析

采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到金黄色葡萄球菌,参考GenBank中发表的FnbpA基因序列,用Oligo 6.0软件设计一对特异性引物。提取分离株中的基因组DNA,经PCR扩增得到1 654 bp的目的片段FnbpA,将其插入PMD18-T克隆载体中构建PMD18-FnbpA重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5α中,并进行测序分析。结果表明,克隆的FnbpA基因片段全长1 654 bp,共编码314个氨基酸。分析表明,FnbpA蛋白基因潜在的蛋白质抗原决定簇有17个,抗原性很强,与16株FnbpA基因标准序列的同源性为77.1%~100%,本研究所克隆的FnbpA基因与AM990992株亲缘性最近。     

大白菜抗霜霉病同源基因的筛选与亚克隆文库的构建

根据植物抗霜霉病基因保守区设计简并引物,利用三维PCR方法对大白菜(Brassica campestris ssp.pekiensis)‘85-1'BAC文库进行筛选,从19 200个BAC克隆中筛选到含有目的基因的10个阳性克隆.利用HindⅡ对其中的94一G-17克隆进行酶切,回收1～5 kb的DNA片段并连接到载...     

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β（IL-1β）全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831 bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期（4 h）白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移（12,24 h）并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。