高等植物启动子功能和结构研究进展

 启动子是控制植物基因表达的重要DNA序列结构,文章简述了启动子的定义、分类和启动子的研究策略。并着重从组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子3个方面介绍了它们的功能和结构的研究现状。提出了植物基因工程中启动子研究存在的问题与展望。     

水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的分离与鉴定

为了挖掘水稻中的逆境诱导型启动子,挑选了1个受干旱胁迫强烈诱导的水稻内源基因Oshox24,分离出该基因的启动子(命名为Oshox24P),通过酶切连接的方法构建GUS报告基因表达载体并转化到受体材料中花11中,通过对转基因后代在不同逆境胁迫下的GUS活性检测,证明该启动子强烈地受到干旱胁迫的诱导,上调表达倍数至十几倍...     

cry Ia基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因cryIa的现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5′端引入了Ω和Kozak序列,3′端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar,该载体含有顺向连接的Ubi-cryIa及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIa可以编码对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

SAGP基因克隆及反义表达载体的构建

为了研究不同启动子驱动的反义SAGP抑制内源ADP-Glc PPase小亚基编码基因表达的效果,创造适于外源基因表达的突变体,利用RT-PCR方法,由马铃薯块茎cDNA克隆获得ADP-Glc PPase小亚基编码基因(SAGP)的1 821 bp cDNA。核酸数据库检索和序列比对分析表明,已克隆的SAGP基因cDNA推测编码607个氨基酸组成的多肽,其中第312和411的天冬酰氨均突变为丝氨酸。以pCambia为基础,分别构建了CaMV35S和GBSSI块茎启动子驱动的小亚基cDNA反义结构植物表达载体。     

牛骨骼肌特异性启动子的筛选

分别构建含有牛骨骼肌α-肌动蛋白（α-actin）启动子、牛骨骼肌肌球蛋白轻链2(mylpf)启动子及牛肌酸激酶(ckm)启动子的荧光素酶报告基因表达质粒。将3种荧光素酶表达质粒分别与含有海肾荧光素酶的质粒共转染牛成肌细胞和牛成纤维细胞。经双荧光素酶检测得到转染成肌细胞,72 h后,α-actin启动子的表达量显著高于mylpf启动子和ckm启动子,转染成纤维细胞72 h后,这3种启动子的表达量和空载体相近。结果表明,α-actin启动子在成肌细胞中的表达效率高于mylpf启动子和ckm启动子;3种启动子在成纤维细胞中的表达量与空载体相近,证明了这3种启动子的骨骼肌特异性。通过对骨骼肌特异性启动子的研究,为外源基因在骨骼肌组织的特异性表达提供了试验依据,为进一步研究转基因肉牛奠定了基础。     

番茄果实特异表达启动子ESp1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件，调节E8基因在果实成熟过程中表达（Deikmaa et al．，1998）。本研究根据GenBank中E8基因的启动子区序列设计引物，从番茄基因组中克隆了该启动子，构建了番茄果实特异表达载体，并通过RT-PCR和gus基因检测了该表达载体的果实特异表达活性。     

马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及活性分析

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。     

毛白杨叶绿体基因启动子和终止子的克隆及其功能鉴定

摘 要：从毛白杨(Populus tomentosa)无性系植株组培苗中提取基因组总DNA，通过合成3对特异性引物，用PCR的方法扩增了包含psbA基因启动子、终止子和16S rRNA基因启动子的叶绿体DNA序列。用BLAST及DNAMAN对克隆序列进行了分析，并结合前人的研究工作，确定了两个启动子Prrn、PpsbA的-35区、-10区以及翻译调控序列等重要调控序列元件和终止子的“TAA”序列。并在序列分析的基础上合成新的引物，准确克隆了毛白杨的叶绿体16S rRNA基因启动子Prrn、psbA基因启动子PpsbA及其终止子TpsbA。利用叶绿体基因启动子的原核表达特性，分别用启动子Prrn（其后添加rbcL基因的RBS序列）和PpsbA及终止子TpsbA分别构建了GFP基因的原核表达载体pSGmT、pPGmT，并以T7启动子为对照构建了GFP基因的原核表达载体pETGm，进行了初步的原核表达实验，检测结果表明：克隆到的叶绿体基因启动子和终止子是有生物学功能的，在大肠杆菌BL21中呈组成型表达，同时还证明了RBS序列在基因表达中的重要性。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．