猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。     

简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原基因的克隆表达及免疫特性分析

为研究简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原的免疫特性,本研究提取了线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增肌钙蛋白类过敏原(Anis1)基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后将anis1基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白。通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,融合蛋白采用Western blotting分析。将纯化的Anis1重组蛋白免疫小鼠,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。酶切和DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组Anis1蛋白,重组蛋白经Western blotting分析证实为目的蛋白,纯化蛋白Anis1免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组蛋白Anis1能被免疫血清识别,说明简单异尖线虫重组蛋白Anis1具有较好的免疫原性和免疫反应性。     

马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因0RF7,并将其克隆到pMDl8-T载体,构建成重组质粒pMDl8-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAVNC-002532株的同源性为99％。表明0RF7是EAV基因组内的保守序列,将0RF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21（DE3）,诱导表达后SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶（GST）下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

捻转血矛线虫HLJ株15 ES抗原基因的原核表达

为了对羊源捻转血矛线虫(H.contortus)15 ES抗原基因进行原核表达,本研究利用RT-PCR技术从黑龙江省羊源H.contortus成虫总RNA中扩增得到相对分子质量15Ku ES蛋白基因(H15 ES),序列分析表明,其核苷酸序列与国外已发表的15 ku排泄分泌抗原基因的同源性为99.78%.将H15 ES克隆至pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-H15 ES,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达蛋白相对分子质量约为35.2 ku.本研究为H.contortus病诊断抗原和保护性抗原的大量制备及H.contortus核酸疫苗的研究奠定了基础.     

狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料。本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克隆至原核表达载体pET28a;经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a;以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白;将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体;Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置。结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础。     

鹅IGF-I基因cDNA的克隆、分析与原核表达

从GenBank中读取鸡、鸭、鹌鹑、火鸡等的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因序列进行分析并设计引物,运用RT-PCR法从五龙鹅的总RNA中克隆了IGF-I基因的完整编码区序列(GenBank登录号为DQ662932).运用生物信息学技术对序列进行分析,结果显示:五龙鹅JGF-I基因的编码区长462 bp,与鸭和鸡基因序列同源性分别为99.6%和98.1%;分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸭、鸡及其他动物的进化关系;同源建模分析发现该基因有3个α-螺旋组成.克隆鹅IGF-I基因表达序列,然后连接到pET-32a载体上进行原核表达.经SDS-PAGE分析发现原核表达产物约为28 ku的融合蛋白,Western杂交分析表明,重组蛋白为目的蛋白.     

海豚Prion基因的克隆与序列分析

动物海绵状脑病是一种动物中枢神经系统发生的一系列致命性神经退行性变化的疾病，包括人的新型变异型克雅氏病（v-CJD）、库鲁病（Kuru）等，动物的羊痒病（Scrapie）、牛海绵状脑病（BSE）、鹿慢性消耗性疾病（CWD）等多种疾病。 Prusiner教授提出，该类疾病的感染因子是一种不含有核酸的淀粉样蛋白颗粒，并命名为Prions（Proteinaceous infectious particles）。目前的研究表明，朊蛋白疾病的传播是由于哺乳动物食用了含有Prion蛋白感染因子的饲料而导致发病，如牛食用了含有痒病因子的肉骨粉发生疯牛病。然而，痒病致病因子只能传染给牛，不能传染给人类；但是经过中间宿主牛以后，该致病因子便可以传染给人类。对于这种现象的产生目前还不明确，有专家指出可能与Prion蛋白不同株系基因序列的变化有关。因此对动物海绵状脑病种间屏障的研究具有重要的意义。     

猪链球菌2型38 000蛋白主要功能区基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的猪链球菌2型38000蛋白基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用PCR方法,以四川分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增38000蛋白主要功能区基因。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接转化宿主菌DH5α,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。将目的片段定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、0.8mmol/LIPTG条件下进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量约为35000的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western blotting)证实该重组蛋白可以与猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。