砂糖桔全长cDNA 文库的构建及病程 相关蛋白基因的克隆与分析

为从分子水平上了解影响砂糖桔生理代谢、生长发育、病虫害抗性和品质的众多基因,以无籽砂糖桔幼叶为材料,应用SMART技术构建了cDNA文库,检测文库发现其库容量达到1.36×106,重组率为95%,插入片段绝大多数分布在0.6~2kb之间,有36%的插入片段是全长cDNA。随机挑选224个克隆进行测序,获得了1个病程相关蛋白基因的全长cDNA序列。将基因序列提交Gen Bank,编号为KJ000019。基因的CDS长429bp,5′UTR为43bp,3′UTR为235bp,编码长度为143个氨基酸残基的蛋白。基因位于第8染色体上,有1个长度为193bp的内含子,基因编码的蛋白质分子量为15.4ku,等电点为6.96。该蛋白N端含有长度约为22aa的信号肽序列,指导蛋白分泌到细胞外;剩余部分是一个典型的Barwin保守结构域,具有几丁质酶的活性,在受到细菌、真菌侵染时可以分解部分真菌和细菌的细胞壁,发挥抗病作用。     

1个油茶Y2SK2型脱水素的全长cDNA克隆及生理功能的预测

以构建的油茶EST文库为基础,采用电子克隆技术,分离克隆一个脱水素基因的全长cDNA序列,该基因的cDNA全长1 406 bp,含一个600 bp的CDS,编码200明的小分子蛋白.推测该基因编码蛋白的分子质量为21 ku,等电点7,暂命名为CoDHNI.同源性分析发现该基因的编码蛋白具有2个Y-片段(DEYGNP),1个S-片段(SGSSSSSS),2个K-片段(KIKEKLPG),属于典型的Y2sIQ型脱水素.经Blast比对,发现富含苏氨酸的Thr-区在各物种间变异显著,推测该区为油茶所特有,有利于在被保护的大分子表面形成水合层;同时还发现一个十分保守的基序:EDDGQGGRRKK,可能有利于脱水素的磷酸化和亚细胞定位.通过与柑桔和拟南芥的脱水素比较,提出CoDHNI有可能缓冲种子脱水胁迫响应时钙离子的瞬时增高,并可结合重金属离子,以减轻活性氧的危害.     

螺旋粉虱体内共生菌的研究

采用变性梯度凝胶电泳技术[denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）]、16S rDNA文库构建技术,以及使用Wolbachia菌特异引物研究在不同寄主上取食繁殖的螺旋粉虱自然种群体内共生菌。结果显示,在不同寄主植物取食的新入侵螺旋粉虱体内共生菌均稳定存在有初级共生菌（Candidatus Portiera aleyrodidarum）,属于变形菌门（Proteobacteria）,γ-变形菌纲,共生菌多样性较少;研究同时发现取食不同寄主植物的螺旋粉虱个体间共生菌群落多样性有一定差异,一些螺旋粉虱个体内还生存有葡萄球菌（Staphylococcus sp.）;此外,研究还发现新入侵的螺旋粉虱体内尚未检测到Wolbachia菌。表明取食不同寄主的螺旋粉虱体内均稳定存在有共生菌,同时取食不同的寄主其共生菌群落也会发生变化;Wolbachia菌尚未在新入侵海南的螺旋粉虱中建立共生关系。     

角毛壳菌降解粗纤维基因的筛选

以角毛壳菌菌丝体为材料,构建cDNA文库并进行了部分表达序列标签(ESTs)的分析。文库的滴度为1.02×106pfu/mL,重组率为95.3%,插入片段平均长度大于1.2kb。在cDNA文库中随机选择克隆从5′端测序得到1219个高质量ESTs,拼接为804条独立基因。其中460条(57.2%)与NCBI中非冗余蛋白质库(NR)已知基因有不同程度同源性的代表已知功能基因,344(42.8%)条独立基因与NR库中基因没有显著同源性的代表未知功能新基因。从已知基因中鉴定出了降解粗纤维的基因:β-1,4-内切葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、β-内切木聚糖酶基因、木糖苷酶基因、漆酶基因。     

鲈α-珠蛋白基因的克隆和序列分析

从鲈头肾cDNA文库中随机挑取噬菌斑,作为模板,以λZAPExpress载体两端含有的T3和T7启动子序列设计引物,用PCR方法扩增插入片断,从中克隆到血红蛋白α亚基的cDNA (Genebank登录号为EU588586).该cDNA包含435 bp的开放阅读框,编码144个氨基酸.计算其可能的分子量为15864.51,PI为8.83.序列比较分析结果表明,在近端与血红素结合的组氨酸高度保守,与大菱鲆α类珠蛋白同源性最高,达83.3%,与金鲈和大西洋鳕的同源性分别为72.7%和67.8%,与非洲爪蟾α-珠蛋白同源性最低,为2339.4%.通过构建系统进化树,对鲈α-珠蛋白的系统演化进行了分析,并对其二级和三维结构进行了预测.     

三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。     

奶山羊细菌人工染色体基因文库构建的初步研究

细菌人工染色体(BAC)文库是进行动物基因组学研究的一个重要手段,为配合山羊乳腺生物反应器的研究,对构建山羊基因组BAC文库进行了初步研究。用H indⅢ酶对莎能奶山羊基因组进行部分酶切,用CHEF(箝位匀强电场)二次电泳法回收150 kb大小条带,电透析回收高分子量(HMW)DNA;同时以BAC载体pB eloBAC 11为材料,分别采用限制性内切酶H indⅢ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,将该载体自连并通过凝胶回收线性段DNA,获得了可用于构建BAC文库的线性载体。将HMW与载体进行连接,电击转化感受态DH 10β大肠杆菌,一次转化得到近2 000个克隆。插入片段大小为50~200 kb,基本满足建库的需要。     

葡萄果实cDNA文库的构建及鉴定

构建葡萄果实cDNA文库是研究果实发育相关基因表达调控的基础工作.本实验从巨峰葡萄果实中提取了高质量的RNA,利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA第一链,用特异引物进行LD-PCR扩增合成双链cDNA.将分级纯化的带有粘性末端双链cDNA与λTrip Ⅰ Ex2载体连接,重组载体体外包埋成为cDNA原始文库.初步鉴定原始文库的滴度为1.32×106 pfu/mL,文库扩增后滴度达1.45×1010 pfu/mL.从扩增文库中随机挑取250个克隆进行PCR鉴定,结果表明重组率为98.7%,插入片段大小在0.5～2.0 kb之间,因此,本研究成功构建了葡萄果实cDNA文库.     

制备棉花高分子量线粒体DNA的方法

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)是普遍存在于植物中的生物学现象.细胞质雄性不育受核质两套遗传系统的控制,决定不育的胞质基因在线粒体基因组中.高等植物的线粒体在小孢子的发育过程中起着重要作用,并且与CMS密切相关.因此,通过构建线粒体基因组BAC文库,克隆相关的线粒体基因,有助于了解CMS不育的机理.