黄瓜幼果cDNA文库构建与EST测序分析

将黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织等量混合后提取总RNA和mRNA,以λTriplEx2为栽体、XL1-Blue为宿主茵,构建了1个黄瓜幼果cDNA文库;其滴度为1.165×106pfu/mL,重组率在94.4％左右.测序获得116条EST,92.2％的长度在400 bp以上,19％为重叠序列.在GenBank中进行BLAST分析后确认与已知功能基因相似的EST序列有71条,有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的EST序列各占19.83％和18.97％.从对文库的检验结果看,构建的cDNA文库重组率较高,库容达到预期要求.     

鲤脑组织cDNA文库的构建及鉴定

用Gubler—Hoffman法构建了耐低温鲤Cyprinuscarpio脑组织全长cDNA文库,经测定库容量为5．7×10^5cfu／mL,文库的重组率接近95％,平均插入片段长度为1500bp,符合文库保存和筛选实验的要求。同时,根据鲤与低温相关的消减eDNA文库中低温下特异表达基因的片段序列,设计了PCR引物,并在此eDNA文库中进行PCR检测和序列测定。使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示,8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率接近75％。     

沙门氏菌诱导后家蝇幼虫cDNA文库的构建

采用沙门氏菌以针刺法诱导家蝇三日龄幼虫,提取诱导后培养24 h的家蝇幼虫总RNA,进一步分离、纯化其mRNA,运用SMART技术构建家蝇幼虫cDNA文库.结果表明:原始文库的滴度为1.55 × 106 pfu/mL,原始文库重组宰为99.5%,文库扩增后滴度达1.27 × 10 pfu/mL.从扩增文库随机挑取10个噬菌斑克隆进行PCR扩增鉴定,结果显示所选的lO个噬菌体克隆均合有重组的cDNA,插入片段大小为400～1 500 bp.     

巨型艾美球虫株间差异表达基因消减文库的构建和分析

为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础.     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8．50×10^6 CFU,重组率在95％左右,插入片断大小为0．5～4．0kb,多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多（27．03％）,与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。     

大白菜抗霜霉病同源基因的筛选与亚克隆文库的构建

根据植物抗霜霉病基因保守区设计简并引物,利用三维PCR方法对大白菜(Brassica campestris ssp.pekiensis)‘85-1'BAC文库进行筛选,从19 200个BAC克隆中筛选到含有目的基因的10个阳性克隆.利用HindⅡ对其中的94一G-17克隆进行酶切,回收1～5 kb的DNA片段并连接到载...     

变态前牙鲆cDNA文库中Ⅰ型微卫星的多态性分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)不仅是研究鱼类变态的模式生物,也是我国的重要水产养殖对象。从变态前牙鲆cDNA文库中的42个单一序列表达标签(ESTs)中筛选到46个微卫星分子标记,从中选择21个微卫星并在一个养殖牙鲆群体共30个样本中测试,结果表明其中有20个微卫星标记具有多态性,其等位基因数为2到6个,观察杂合度从0.06到1.00,期望杂合度从0.059 7到0.825 2变化不等,平均多态信息含量是0.457 5,可用于牙鲆连锁图的构建和分子标记辅助选育。其中,有3个微卫星位点的三核苷酸重复序列在基因编码区内,可能和基因功能有关。     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。