禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NL-RP3.以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线.通过反应条件...     

魔芋软腐病病原菌TaqMan荧光探针PCR技术的建立及应用

为实现对田间土壤软腐病病原菌的定量检测,基于魔芋软腐病优势病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum的FyuA基因序列,设计特异性引物PCC1/PCC2/PCC3,建立TaqMan荧光探针实时荧光定量PCR技术,并对魔芋根系土壤中软腐病病原菌进行动态监测。结果显示:基于FyuA基因序列设计的引物特异性好,仅能特异性检出胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种;当模拟带菌土壤中病原菌浓度低至1.88 CFU/g时也能检出,灵敏度高;发病魔芋根际土壤中软腐病病原菌检出率为100.00%,病原菌DNA浓度最高达到了7.52×10~7ng/μL,健康魔芋根际土壤中也存在病原菌,检出率为40.00%;不同种植模式中,林下魔芋土壤中软腐病病原菌数量较少;连作时间与病原菌数量、病情指数存在正相关关系,连作时间越长,病原菌积累越多,魔芋病情指数也越高,魔芋连作4年土壤中病原菌DNA浓度最高达到4.03×10~4ng/μL;对魔芋土壤软腐病病原菌进行全年监测,病原菌数量随着月份增长逐渐上升,在8—10月达到峰值543.20 ng/μL后下降,病原菌数量与魔芋病情指数变化规律一致,但田间魔芋软腐病的发生相对滞后。表明建立的TaqMan荧光探针实时荧光定量PCR技术可用于田间魔芋软腐病的监测。     

湖南柑橘衰退病调查分析及弱毒系筛选

 The investigation showed that stem-pitting Citrus tristeza virus (CTV)occurred commonly in citrus production areas in several varieties of Hunan Province. Accurate detection of CTV strains was performed by p23/PCR method, PCR and the results indicated that the most samples were infected with several CTV isolates. Three mild strains were isolated and their pathogenicity was identified by biological identification, it indicated that p23/PCR groups had uniformity with the pathogenicity of CTV isolates. Furthermore, three mild isolates were tested in the cross protection by analysis of biological symptoms and composition of p23 gene. Different protecting effects were observed among these strains and W17 mild isolate was effective.     

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA29，设计了1对引物和3条探针，建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR-ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针，边扩增边检测，步骤简单，不需PCR后处理，可避免假阳性和交叉污染；诱捕PCR-ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测，减少了核酸不纯出现的漏检，由于增加了核酸杂交探针，可不需凝胶电泳EB染色检测，不会出现假阳性问题。     

潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

免疫吸附PCR技术提高梨火疫病菌检测灵敏度

本研究采用已经发表的引物和制备的梨火疫病菌抗血清,研制了免疫吸附-PCR技术,使其检测梨火疫病菌纯菌的灵敏度比标准PCR技术提高10倍;检测模拟样品中的梨火疫病菌灵敏度提高了1000倍;从相关混合菌液中能够更加灵敏和准确地检测出梨火疫病菌.该方法简单易行,准确灵敏,具有广阔的应用前景.     

中国美利奴羊PROP1和PRLR基因的表达分析

本研究旨在探讨PROP1和PRLR基因在绵羊不同组织中的表达差异及其发育变化规律。利用荧光实时定量PCR技术分析了PROP1和PRLR基因在中国美利奴成年母羊13种组织中的表达谱信息,并检测了垂体组织中PROP1基因和垂体、卵巢、睾丸和皮肤组织中PRLR基因在0、7、14、30、60和90日龄时表达水平的发育变化。结果表明:PROP1基因仅在绵羊垂体组织中表达;而PRLR基因在绵羊各种组织中广泛表达,且在子宫和下丘脑组织中的表达量高于其它组织(P<0.01)。垂体组织中的PROP1基因表达量较低,在7日龄高于30(P<0.01)、14和60日龄(P<0.05)。垂体组织中PRLR基因表达量在30日龄时最高,之后急剧下降,各日龄间无差异(P>0.05);在卵巢组织中从7日龄起呈先下降后上升的趋势,90日龄高于0(P<0.01)、14和30日龄(P<0.05);在睾丸组织中总体呈上升趋势;在皮肤组织中呈现为生长前期高于后期的趋势(P<0.01)。绵羊PROP1和PRLR基因表达存在明显的组织表达差异和发育变化差异;PROP1和PRLR基因的表达可能对绵羊繁殖等性状的发育有一定的调节作用。     

A serological and molecular study on Francisella tularensis in rodents from Hamadan province,Western Iran

Introduction and purposeTularemia is a zoonotic disease, the most important hosts of which are rodents. Endemic regions and reservoirs of F. tularensis are not well-researched areas in Iran. The present study aimed to study F. tularensis infection in the rodent populations of western Iran.Materials and methodsSamples were collected in different areas of Kabudar Ahang County in Hamadan province (west of Iran) from 2014 to 2017. Tularemia serological and molecular tests were conducted using the tube agglutination test and Real-time PCR method tracking the ISFtu2 gene. Positive serum samples were evaluated for cross-reactivity with brucellosis.ResultsA total of 433 rodents, collected from 33 localities, were included in the study. The most abundant species belonged to the Persian jird (Meriones persicus; 75.5%), and Libyan jird (Meriones libycus; 10.1%). Among the studied samples, three (0.74 %) were seropositive and five (1.15%) were PCR positive. Seropositive samples were two M. persicus and one M. libycus, and PCR positive rodents were four M. persicus and one M. vinogradovi. Tularemia seropositive samples showed no cross-reactivity with brucellosis.ConclusionGiven the presence of infection in rodents with tularemia agent in the studied area, it is crucial to elucidate the risks of rodent exposure to tularemia for physicians, health personnel and the general population.     

番茄溃疡病菌PCR快速检测技术

番茄溃疡病是一种严重危害番茄生产的细菌性病害，许多国家将其列为检疫性病害。利用ITS通用引物扩增了番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）的ITS序列，并进行克隆测序。根据序列比较结果设计了引物BT1和BT2，该引物特异性好，能专一扩增出268bp电泳条带，而马铃薯环腐病菌等不同亚种、不同属的细菌及健康的番茄材料均无扩增条带。从接种但未显症番茄苗叶片及人工模拟染菌种子上提取总DNA，以此为模板均能稳定地扩增出特异性目的条带。该方法直接对种子或植株进行检测，不需进行病原菌分离培养，快速简便，适用于出入境检验检疫及种苗健康检测领域。     

微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析

应用多个抗原袁位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞袁位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm.将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列.Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础.