应用GatewayTM技术构建烟草抗真菌病相关基因的RNAi载体

根据抗病基因(Resistance genes,R基因)的功能保守域,利用生物信息分析方法在绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)全基因组上获得6个完整可靠的抗真菌病候选基因.在这6个基因的非保守区设计特异引物,以普通烟草品种红花大金元反转录cDNA为模板克隆抗真菌病相关基因的干扰片段,利用GatewayTM克隆技术构建上述候选基因的RNAi载体,经酶切和测序证明载体构建正确,为进一步鉴定这6个候选基因的具体抗病性,并为将其应用于烟草抗病新品种的选育工作奠定了基础.     

Patent analysis provides insights into the history of cotton molecular breeding worldwide over the last 50 years

Cotton is a globally important natural fiber and oilseed crop of crucial economic significance. Molecular breeding has become a dominant method of cotton cultivation because it allows for a shorter breeding period and directional selection of high quality genes. Patent data are key resources and are the core competitiveness of agricultural development, as the world's largest and most reliable source of technical information. However, little attention has been paid to patent analysis of cotton molecular breeding. This study uses bibliometric analysis methodology and technical classification indexing to reveal global development trends of cotton molecular breeding, based on patents by retrieval methods and expert screening. The annual number of patents, the life-cycle of patent-based technology, patent portfolios of primary countries, and main patentees, as well as technical distribution of patents, were analyzed in this study. In addition, this study put emphasis on the comparative analysis of two important patentees through patent roadmaps based on the relationship among patent citations. Finally, in order to understand the trend of new molecular breeding technology, patents related to clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), RNA interference (RNAi), and gene chip were also analyzed, all of which apply to cotton but also to other crops. Results in this paper can provide references for cotton molecular breeding researchers and relevant management departments.     

甘蓝型油菜花序长发夹ｌｈＲＮＡｉ文库的构建

异源四倍体油菜含有大量多拷贝基因及冗余基因,难以通过T-DNA插入、物理及化学诱变等常规突变体库创制方法发掘功能基因。为开发适应于油菜的简单高效的突变体库创制方法,本研究通过滚环复制方法构建了甘蓝型油菜的花序lhRNAi文库,并对这种新型的干扰文库进行质量评估;然后将该花序lhRNAi文库对甘蓝型油菜进行遗传转化,获得763株T0植株,从中鉴定分离出74株具有可见表型变异的花发育相关突变体,包括花瓣减少、形状异常,柱头卷曲,雄蕊退化萎缩,雄性不育（不能产生花粉）、死蕾或花蕾闭合等。说明通过滚环复制介导的lihRNAi文库的构建方法可以成功应用到油菜中,这将为油菜花序发育相关基因功能的研究提供重要的研究平台。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

一种植物RNAi双元载体的构建

[目的]为利用RNAi技术研究植物基因组功能奠定基础。[方法]通过PCR技术克隆一系列RNAi双元载体所需要的元件：绿色荧光蛋白基因（gfp）、花椰菜花叶病毒启动子（CamV35S）、氨基糖苷3＇-腺苷酰基转移酶基因（aada）、胭脂碱合成酶基因终止信号（nos）,并进行组装,在双元载体质粒pCAMBIAl301的基础上构建目的载体。[结果]通过7种中间载体的构建,最后成功得到双元载体质粒pHBMT14。[结论]该载体的成功构建为以后的植物基因组功能研究提供了技术平台。     

RNAi技术在转基因猪中的应用研究进展

RNAi技术介导的转基因小鼠的出现,预示着在哺乳动物整体水平上研究靶基因的敲除成为可能。目前,针对家畜这一类较大的动物,出现了RNAi技术介导的转基因猪,为应用RNAi技术培育抗猪病毒新品种奠定基础。文章以RNAi转基因猪为代表,阐述了RNAi技术在哺乳动物细胞中特殊的现象及最有应用前景之一的抗病毒逃逸方法,并详细介绍了RNAi技术在抗病转基因猪中的研究进展。     

芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究

[目的]研究芥菜Cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化,为后期对两者关系的进一步研究提供参考。[方法]在克隆芥菜类茎瘤芥Cry2基因的基础上,构建该基因的RNAi载体,并导入根瘤农杆菌GV3103,获得工程菌株后,通过农杆菌浸染茎瘤芥子叶外植体进行植物体转化,并验证转化结果。[结果]成功构建了茎瘤芥Cry2基因的RNAi载体,并建立了茎瘤芥遗传转化体系,获得了转基因植株。[结论]茎瘤芥Cry2 RNAi的构建及遗传转化体系的建立为后期深入研究茎瘤芥熟期相关基因的功能及基因工程应用奠定了基础。     

采用一种新型RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯

采用PCR技术分别克隆nos终止子、烟草axi1内含子和烟草ubi.u4启动子,亚克隆部分与马铃薯Sbe1同源、部分与Sbe2同源的融合基因SIII,构建具有“ubi.u4启动子—反向SIII—反向nos终止子—axi1内含子—正向nos终止子”结构的异源3¢端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI,采用农杆菌介导法转化马铃薯品种陇薯3号、甘农薯2号和大西洋,获得了16个转基因植株,其中14个的块茎直链淀粉含量大幅度增加,表观直链淀粉含量介于53.80%~85.33%;但随着直链淀粉含量的升高,转基因马铃薯淀粉含量下降。半定量RT-PCR分析表明,在直链淀粉含量超过80%的转基因株系中检测不到Sbe1和Sbe2基因mRNA的积累。结果表明,异源3¢端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI能够高频、高效地同时抑制马铃薯Sbe1和Sbe2基因的表达,是一个优良的RNAi载体。以载体pCUSNI为基础,再以植物的其他基因为靶,只需在pCUSNI的BamH I和Sac I位点之间插入干涉片段替换SIII即可完成载体构建,而不必构建靶标基因的反向重复序列,使载体制备迅速便捷。     

白星花金龟幼虫血腔注射干扰体系构建

本研究针对重要的农业害虫白星花金龟Protaetia brevitarsis幼虫,建立RNA干扰体系,以期为免疫相关基因功能研究奠定基础。通过血腔注射dsRNA,成功干扰了肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition protein LB,PGRP-LB)基因的表达,发现dsRNA注射量为9μg,注射后48 h取样,pgrp-lb基因沉默效率最高。通过血腔注射对白星花金龟无杀虫活性的Bt菌株G03,发现pgrp-lb基因沉默破坏了白星花金龟幼虫的免疫防御系统,显著提高了白星花金龟对G03菌株的敏感性。表达免疫识别基因dsRNA菌株的构建,将为白星花金龟的生物防治提供新思路。