大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

杂色鲍原代细胞培养方法的优化及其在基因功能研究中的应用

优化了杂色鲍原代细胞的培养条件,并利用原代细胞进行了RNAi和外源基因表达。结果表明,较高的渗透压对血淋巴细胞培养起重要作用,淋巴细胞分离液分离血淋巴细胞更利于其生长。原代细胞培养至第5天,在细胞培养液中添加50μg My D88 dsRNA,能够显著降低My D88 mRNA的表达。p EGFP-N1转染培养5 d的鳃细胞,5 d后可以检测到绿色荧光。该研究表明可以成功培养杂色鲍血和鳃原代细胞,并且利用原代细胞可以进行功能基因表达量调低或调研究,为功能基因注释提供了便利条件。     

水稻蛋白激酶OsCIPK5的亚细胞定位分析及RNAi转基因水稻的获得

在植物生长发育中,CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在胁迫信号转导和增强抗逆途径中发挥着重要作用,而OsCIPK5的具体功能还未知。为了研究OsCIPK5的功能,本研究从日本晴水稻中成功克隆了OsCIPK5基因。用生物信息学方法对其编码的蛋白进行分析,结果表明OsCIPK5含有2个功能区即激酶活性区和NAF区,OsCIPK5与5种植物的CIPK5同源性较高,而与短花药野生稻CIPK5的同源性最高(94%),亲缘关系最近。利用植物生理学方法对水稻进行低钾处理,结果表明水稻根中OsCIPK5受低钾诱导表达,而叶片中OsCIPK5表达量没有变化;同时构建了OsCIPK5与黄色荧光蛋白基因融合的植物瞬时表达载体,共聚焦显微镜观察显示,OsCIPK5编码的蛋白主要定位在细胞核、细胞膜,还以颗粒状结构不规则分布在细胞质中。进一步构建了OsCIPK5的RNAi载体,通过水稻遗传转化体系获得26株阳性转基因水稻。荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析表明,T1代转基因水稻中OsCIPK5的表达量与野生型相比显著降低。OsCIPK5的生物信息学分析、植物生理学分析、亚细胞定位以及RNAi转基因水稻的获得为研究OsCIPK5的功能奠定了基础。     

OsGA20ox2不同长度RNAi片段对水稻株高等农艺性状的遗传效应

利用OsGA20ox2基因序列构建不同长度的RNAi片段并导入水稻，获得不同高度的矮化植株。将这些矮化植株与野生型植株回交获得B₁F₂群体，卡方检测表明B₁F₂群体矮秆植株数和高秆植株数符合3∶1比例，表现为矮秆显性的遗传规律。对矮化植株的F₅和B₁F₂群体株高、各茎节间长度和一些主要农艺性状方差分析显示, OsGA20ox2基因的RNAi能显著缩短株高和各节间长度(P<0.05)，RNAi干扰片段越长，使植株株高和节间长度缩短程度越大，可使株高降低24~42 cm，矮化22%~39%。在同一长度的RNAi干扰片段下，倒一节节间长度平均缩短与倒二节节间长度平均缩短非常相近，倒三节和倒四节节间长度平均缩短非常相近，总的缩短程度是倒四节>倒三节>倒二节>倒一节。这种近基部节间长度缩短幅度和比例较大的特点，利于提高水稻的抗倒伏能力，同时上部节间缩短幅度和比例较小，有效地保持合理株高，不使生物产量明显降低，有利于水稻的稳产和高产。OsGA20ox2基因的RNAi不影响如千粒重、结实率、穗长等其他主要农艺性状或影响很小。     

RNAi导致基因沉默的机制和应用进展

RNAi主要通过双链RNA(dsRNA)被核酸酶切割成21~23 nt的干涉性小的RNA,即siRNA,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现的；RNAi需要多种蛋白质因子以及ATP参与,而且具有生物催化反应特征；RNAi具有高效性和高度特异性,作为一种关闭特定基因的新技术,为基因功能研究提供了一个快速、简便的方法,在后基因组时代应用前景广阔。     

昆虫几丁质合成关键酶功能及其RNAi技术在害虫防治中的研究进展

几丁质对昆虫的生长发育至关重要,且不存在于植物和哺乳动物中,因此其合成途径的关键酶是较为理想的杀虫剂靶标。近年来,多种害虫的几丁质合成关键酶基因被克隆和鉴定,通过RNAi技术应用于一些重要害虫的防治研究工作中。本文较为系统的总结了近些年害虫几丁质合成关键酶的基因克隆及功能研究进展,重点阐述了几丁质合成酶、海藻糖酶基因基于RNAi技术应用于害虫防治取得的研究进展,分析了RNAi技术通过转基因植物表达dsRNA（RNAi抗虫作物）以及作为核酸农药（dsRNA）直接进行作物喷施的两种应用途径,文章最后还探讨了RNAi在害虫防治中面临的主要瓶颈问题以及主要应对策略。上述较为系统的归纳和总结,目的是为今后基于几丁质合成关键酶的RNAi技术应用于害虫绿色防控研究提供有价值的理论指导。     

布鲁菌感染小鼠RAW264．7细胞对IRGl基因的表达调控作用

针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。     

RNAi技术概述

RNAi(RNA interference)是指外源性双链RNA(dsRNA)能抑制细胞内与其序列同源的基因的表达。在进化上,这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的生理机制。本文对RNAi技术进行介绍。     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。