RNAi抑制PrP表达载体的构建及其在PrP功能研究中的初步应用

本文旨在构建有效抑制朊蛋白（Prion protein，PrP）表达的重组质粒，并以此为工具控制PrP表达，从而探讨PrP对细胞SOD活性的影响。设计并化学合成1对含有发夹结构的寡核苷酸片段（shPrP），退火后与表达载体pG-super（Hairpin siRNA expressing vector）定向连接，构建重组质粒pG-super-shPrP。对重组子进行PCR鉴定，测序正确后，脂质体法转染C6细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测PrP mRNA的表达水平，以验证pG-super-shPrP的抑制效率；结果表明：重组质粒pG-super-shPrP构建成功，且显著降低C6细胞PrP mRNA表达（P〈0．05），抑制效率为34．2％。利用pG-super、pG-super-shPrP分别转染C6细胞，并检测细胞SOD总活性及SOD表达水平，探讨PrP对细胞SOD活性的影响及其作用机制，结果表明PrP促进细胞SOD的活性（P〈0．01），但对细胞SOD的表达量无影响，即PrP对SOD活性的促进作用与SOD1的表达量无关。本研究在成功构建了PrP的RNA干扰表达质粒的基础上，利用此质粒，在细胞水平上揭示了PrP对细胞SOD活性的促进作用。     

RNAi技术及其在植物分子生物学中的应用

RNA干扰(RNA interference，RNAi)，即用二十多个核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域。本文概述了RNAi的作用机制和近年来的研究进展，同时介绍了RNAi在植物分子生物学中的应用情况，主要包括植物基因功能的研究，植物的品质改良和植物中的转录后基因沉默(PTGS)。     

RNA干扰研究现状

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。简要概括RNAi作用机制和siRNA技术的原理,同时也讨论了RNAi技术在其他领域,如在基因信号通路研究、高通量研究基因功能、基因治疗如肿瘤研究和疾病治疗等方面的应用。     

基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核型多角体病毒复制

基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19~+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。     

慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

南瓜蚜传黄化病毒P0蛋白基因ihpRNA载体构建及烟草转化

P0蛋白是南瓜蚜传黄化病毒基因组编码的基因沉默抑制子。根据已克隆的CABYV P0蛋白基因序列,设计带酶切位点的特异性引物,PCR扩增用于构建RNAi表达载体的P0蛋白基因正反义片段。将正反义片段分别插入到含有内含子的中间载体pBSint上,得到重组的中间载体pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I双酶切pBSint-P0-F-R,将切下的包括内含子和正反义P0蛋白基因在内的片段定向克隆到植物表达载体pCambia1300上,得到含有发卡结构的RNAi表达载体pCambia-P0-F-R。通过农杆菌介导的方法将该表达载体转化本生烟,经PCR检测,得到4株阳性转基因植株。为设计出更广谱、特异有效的抗病毒策略及研究病毒蛋白的功能特性及其侵染机制提供实验材料。     

甘蔗螟虫生物防治策略展望

综述了甘蔗螟虫生物防治的主要策略及研究进展,并探讨了运用RNA干扰技术防治甘蔗螟虫的新策略,为通过转基因技术创制抗甘蔗螟虫新种质提供理论参考。     

RNA interference in Colorado potato beetle(Leptinotarsa decemlineata): A potential strategy for pest control

Colorado potato beetle(CPB), Leptinotarsa decemlineata, is a notorious destructive pest that mainly feeds on the leaves of potato and several other solanaceous plants. CPB is widely recognized for its adaptation to a remarkable variety of host plants and diverse climates, and its high resistance to insecticides and Bacillus thuringiensis toxins. RNA interference(RNAi) is a sequence-specific, endogenous gene silencing mechanism evoked by small RNA molecules that is used as a robust tool for virus and pest control. RNAi has been extensively tested for CPB management by employing various target genes and delivery methods. This article reviews the screening of RNAi target genes, efficient RNAi delivery systems, and factors affecting RNAi efficiency in CPB, which may help understand the mechanisms of RNAi and its application in CPB control strategy.     

花生△12-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。