利用简化的SDS法提取杨树基因组DNA

以杨树组培苗幼嫩叶片为材料,在室温下采用简化的SDS法快速制备其基因组DNA,并对制备DNA过程中的影响因子进行了初步研究。结果表明,采用此方法制备的基因组DNA在数量和纯度上可以满足聚合酶链式反应(PCR)的要求。另外,DNA提取缓冲液中添加一定浓度的PVP、β-巯基乙醇,有利于DNA提取。     

快速提取分离八角茴香油的新方法

将回流提取法、水蒸气蒸馏法、快速提取法对八角枝叶或干果中八角茴香油提取进行了比较,并确定八角枝叶或干果中八角茴香油的最佳提取方法和条件。结果表明,快速提取法比回流提取法、水蒸气蒸馏法提取效率高,快速简便。快速提取法提取八角茴香油的最佳条件为:干果原料与水比为1∶6,提取回流时间为2 h,产品收率达12.78%,且含八角茴香脑90.83%。     

7株牛源A型巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

对2014年沈阳地区患有呼吸系统疾病的育肥牛场进行病原分离,得到7株分离菌,对其进行培养形态及染色观察、病理组织切片观察、动物致病性观察及16S序列分析,初步鉴定为牛多杀性巴氏杆菌(Pm)。利用Pm种特异性引物及荚膜血清特异性引物进行PCR扩增,均得到目的基因条带。对分离菌进行药敏试验的结果显示,5株分离菌株已对阿米卡星、新诺明产生较强耐药性;7株分离菌均对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素及氨苄西林敏感。由此确定,分离菌株均为牛荚膜A型巴氏杆菌,且已具有一定耐药性。     

羊流产衣原体的分离鉴定及间接免疫荧光法检测

对收集的疑似衣原体感染的羊流产胎儿样本接种鸡胚卵黄囊进行分离培养,通过PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析)方法鉴定为流产衣原体。将收集到的流产衣原体阳性样本接种Hela229细胞,应用基于流产衣原体MOMP单克隆抗体的间接免疫荧光法,在Hela229细胞浆内可见呈绿色荧光的衣原体包涵体,进一步在病原学水平上确定发生在甘肃省肃南县羊流产的病原为流产衣原体。     

犬细小病毒JL-M13株的分离鉴定及全基因组序列分析

将检测为犬细小病毒(CPV)阳性的病料经处理后接种F81细胞盲传3代并获得一株细小病毒,命名为JL-M13。应用重叠PCR技术从JL-M13中扩增出5条核苷酸序列,拼接后进行序列分析。结果表明,所获病毒核酸基因组大小为4 621bp,与其他犬细小病毒的基因相似性为98.2%~99.4%。系统发育树分析表明,JL-M13与CPV-2毒株(EF011664.1)相似率最高,与Type-2型犬细小病毒疫苗株相距较远。     

仔猪雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定及系统进化分析

为了解猪雷极氏普罗菲登斯菌(P.rettgeri)的生物学特性、致病性及16SrRNA基因系统进化关系,从发生严重腹泻、血便的哺乳仔猪群的内脏器官中分离到1株病原菌,根据形态特征、培养特性、生化特性、16SrRNA基因序列分析鉴定为P.rettgeri。小鼠攻毒试验证实,该分离菌株对试验小鼠有较强致病力,哺乳仔猪回归试验可复制出与临床上相似的典型症状,并从发病死亡小鼠及哺乳仔猪中分离到攻毒菌株。系统进化分析表明,分离菌株与雷极氏普罗菲登斯菌系统进化关系最为密切,其16SrRNA基因序列与雷极氏普罗菲登斯菌代表菌株的同源性在97.3%~99.6%之间。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢唑啉、头孢呋肟、头孢吡肟、阿莫西林、链霉素、氨曲南、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、米诺环素、链霉素、阿米卡星等多数药物敏感。首次报道了雷极氏普罗菲登斯菌可以引起哺乳仔猪严重腹泻,提示在仔猪腹泻中应注意该菌感染的诊断、监测和防控。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

1株猪丹毒杆菌的分离与鉴定

为确定导致安徽和县某猪场猪只发病的病原,从该猪场送检病料(心、肺、脾、肝)中分离并纯化细菌,根据其形态特征、PCR鉴定及生化试验结果,确诊为猪丹毒杆菌。spa A基因序列分析结果显示该菌与猪丹毒杆菌G4T10(Gen Bank登录号:KF150604.1)有99%的同源性。全自动生化反应报告该菌为丹毒丝菌的概率高达95%。小鼠攻毒试验表明,试验组小鼠在腹股沟皮下注射该菌后,4 d内全部死亡;死亡小鼠剖检可见全身败血性出血,各脏器均有病变,从死亡小鼠的血液、心、肝、脾、肺等组织中分离到与该感染菌株形态特征完全一致的细菌。药敏试验结果表明,该菌对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素敏感,对链霉素、卡那霉素、四环素、多西环素、林可霉素和磺胺异恶唑耐受。     

青海高原禾草内生真菌资源的调查和分离

青海高原的高寒特性决定其生境内禾草植物的多样性和特异性,然而有关青海高原地区禾草内生真菌的研究报道较少,本研究对青海高原地区48个样点内禾草植物内生真菌带菌率和内生真菌分离进行了研究.结果表明,14种禾本科植物内生真菌平均感染率低于50％,而12种植物内生真菌平均感染率大于50％.其中,缘毛鹅观草(Roegneria pendulina)、紫花针茅(Stipa purpurea)、醉马草(Achnatherum inebrians)、中华羊茅(Festuca sinensis)、硬质早熟禾(Poa sphondylodes)、微药羊茅(F.nitidula)、毛稃羊茅(F.kiritowii)和紫羊茅(F.rubra) 的平均带菌率均超过80％.同时,同属禾草植物内生真菌带菌率存在差异.禾草内生真菌分离率较低,其中紫花针茅、麦宾草(El ymus tangutorum)、光稃早熟禾(P.psiolepis)和异针茅(S.aliena)内生真菌在菌落和分生孢子形态上存在差异.可见,青海高原禾草内生真菌带菌率较高,同时不同禾草内生真菌可能存在多样性.     

Evaluation of embryonic age and the effects of different proteases on the isolation and primary culture of chicken intestinal epithelial cells in vitro

The present study evaluates the effects of embryonic age and proteolytic enzymes on the isolation and primary culture of chicken enterocyte and to establish an effective technique for chicken intestinal epithelial cell (IEC) cultivation. Fourteen‐day‐old, 16‐day‐old and 18‐day‐old embryos (average weight: 52.23 ± 0.76 g, 50.86 ± 0.99 g, 48.98 ± 1.03 g) were the source for preparation of enterocyte culture, and trypsin‐ethylene diamine tetraacetic acid, collagenase, thermolysin and combination of collagenase and thermolysin were used for digestion medium. Optimal culture protocols were determined by qualitative assays of proliferation. Cells isolated by using 14‐day‐old embryo and collagenase obtain the best attachment and growth in culture, and the production of continuously growing IEC cultures. Thus, we conclude that the use of collagenase as a dissociating enzyme and 14‐day‐old embryo as a source can be advantageously applied to the isolation of chicken IEC and this method may be useful for various applications and basic studies of the intestinal tract concerning such objects as physiology, immunology and toxicology.