聚合酶链反应检测猪细小病毒的研究

本研究成功地建立了检测猪细小病毒（ＰＰＶ）的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术。以１６个核苷酸引物对首次完成了ＰＰＶＤＮＡ结构蛋白ＶＰ１编码区２２８ｂｐ片段的扩增。同样数目的另一引物对，也成功扩增了Ｖｐ２编码区１５８ｂｐＤＮＡ片段。ＰＰＶＢＭ－１株与其它国内分离株（广西株、天津株和哈尔滨株）均出现相同扩增结果。琼脂糖凝胶电泳显示了特异条带（ＶＰ１２２８ｂｐ．Ｖｐ２１５８ｂｐ），而伪狂犬病病毒、犬细小病毒均未扩增，表明了本方法的特异性。同时，限制性内切酶分析（Ｖｐ１２２８ｂｐ及Ｖｐ２１５８ｂｐ分别含单一ＰｖｕⅡ、ＥｃｏＲⅠ位点），也证实了特异性。本方法敏感性高，可检出１０ｆｇ模板ＤＮＡ。既可作样品的快速检测，又能检查细胞系的污染。具有特异、简便、快速的优点。     

猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立

对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVIV系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明：建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道（通用型）和TAMRA信号通道（Ⅱ系疫苗毒特异型）的检测灵敏度分别可达10^1 TCID50/mL和10^2 TCID50／mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。     

小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立

构建了小反刍兽疫病毒(PPRV)辅助质粒和微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1N、P和L基因,亚克隆至有T7启动子的原核表达载体pGEM3Z构建完成3个辅助质粒,分别命名为pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L,并通过全基因合成构建含PPRV病毒5′端启动子序列(AGP)、3′端启动子序列(GP)、T7转录终止信号、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰转移酶(CAT),获得PPRV微型复制子重组质粒pGEM3Z-CAT。构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达T7RNA多聚酶(T7RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通过脂质体法优化4种质粒配比,并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况,荧光显微镜观察到荧光的表达,并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达,表明构建的PPRV微型复制子具有转录和复制功能,这将有助于进一步开展以PPRV反向遗传操作为基础的免疫学及蛋白功能研究。     

应用套式PCR分段扩增犬瘟热病毒融合蛋白的全基因

为研究犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白各段功能,根据ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列,设计合成了１０条寡聚核苷酸引物。对此１０条引物进行不同的配对,将１株犬瘟热疫苗弱毒株细胞培养物的总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增,利用１次ＰＣＲ扩增得到了７个基因片段,最长的达１６６９ｂｐ,最短的为３１４ｂｐ;应用套式或半套式ＰＣＲ,扩增得到了能覆盖整个融合蛋白基因的８个片段     

河南省樱桃谷鸭乙型肝炎病毒全基因组克隆与序列分析

对河南省樱桃谷鸭主产区信阳、新郑、焦作三地628份樱桃谷鸭血清样本应用PCR技术进行鸭乙型肝炎病毒（DHBV）检测,并将三地DHBV阳性样本各挑选1份进行DHBV全基因的扩增、克隆、测序及序列分析。结果显示,信阳、新郑、焦作三地樱桃谷鸭DHBV自然携带率分别为10.5%、8.9%、17.6%;3株DHBV基因组全长分别为3 021、3 027、3 024bp,均含有编码P、S和C蛋白的3个开放阅读框,各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显著的区域位于P蛋白。序列分析显示,3株DHBV河南株核苷酸同源性为89.8%~93.9%,与参考株为89.4%~99.5%。遗传进化分析及P蛋白关键位点分析结果表明,信阳分离株为西方基因型,其余2株为中国基因型。本试验掌握了河南省樱桃谷鸭主产区DHBV自然感染情况,并成功克隆了3株樱桃谷鸭DHBV全基因序列,为该病毒的进一步研究提供了有益信息。     

鸵鸟传染性喉气管炎病毒的分离鉴定

经临床症状、病理变化观察、琼脂扩散试验、病毒分离以及人工接种试验确诊为鸵鸟传染性喉气管炎。并通过自制组织灭活菌，紧急预防接种等综合防制措施控制了疫情。     

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的血清学分型研究

本文动用气管环血清中和试验对１２个ＩＢＶ毒株进行了血清研究。以气管环纤毛运动为指示系统，以能中和２．０ｌｏｇ１０ＣＤ５０同源病毒血清效价为１个抗体单位，含２０个抗体单位的血清与等量病毒作用测定血清对纤毛运动保护百分率，以欧氏距离数字分类分型，并用ＳＰＳＳ软件聚类分型分析。     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测

经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。