苹果转基因研究进展

近年来,苹果遗传转化研究取得了较大的进展,已有多种标记基因和目的基因成功转入苹果中并且得到稳定表达和遗传。农杆菌介导法是苹果上应用的主要转化方法,叶片再生不定芽途径是被广泛应用的受体系统。影响农杆菌介导成功与否的因素很多,文章从转化方法、叶片再生能力、菌株类型以及农杆菌侵染条件等方面综述了目前有关研究成果,指出目前依然存在转化效率不高、外源基因表达强度不够、对转化植株的选择不够重视等诸多问题。     

叶面喷施硼肥对富士苹果品质和香气成分的影响

以15年生海棠砧烟富1号品种为试材,研究了叶面喷施0.05%、0.10%和0.15%的硼酸对富士苹果品质和香气成分的影响。结果表明:随硼酸浓度的增加,富士果实中的可溶性固形物、可溶性糖含量呈增加趋势,平均单果重、硬度和可滴定酸含量无明显差异;叶面喷施一定浓度的硼酸能显著增加富士苹果果实挥发性物质种类和含量,且在本试验的浓度范围内,随叶面喷施浓度的增加,果实挥发性物质含量和种类呈逐渐增加的趋势。     

苹果根系生理和叶片光合对地面不同覆盖物的差异反应

【目的】揭示苹果根系和叶片对地面覆盖稻草苫等材料的差异性反应,为果园地面合理覆盖提供依据。【方法】于春季将稻草苫、农用地毯、园艺地布和透明塑料膜覆盖在3年生‘红星’苹果树地面,以清耕为对照,于翌年仲春、夏末、中秋和初冬调查根系活力、根系一氧化氮（NO）生成速率、根系硝酸还原酶（NR）和一氧化氮合酶（NOS）活性以及叶片净光合速率（Pn）等生理参数的变化,在秋冬季分析植株生长量及根系构型等。【结果】苹果根系活力、根系NO生成速率和叶片Pn等生理变化对4种覆盖物的反应存在明显的季节差异。春季,4种覆盖物均提高了根系活力、根系NR和NOS活性及NO生成速率,其中透明塑料膜和农用地毯的效果更显著;夏季,稻草苫和农用地毯覆盖显著提高上述所测根系生理参数值,而透明塑料膜使这些参数值显著降低;秋季,4种覆盖均显著提高根系NR和NOS活性;初冬,稻草苫、农用地毯和园艺地布覆盖均显著提高所测根系生理参数值。除了春季,4种覆盖物对根系生理参数的提高,均以稻草苫的效果最显著。4种覆盖物均降低根系生理参数的变异性,其中,农用地毯覆盖下各参数变异最小,透明塑料膜覆盖下变异最大。4种覆盖物均显著提高夏末、中秋和初冬的叶片Pn及秋季叶片水分利用效率（WUE）,增大初冬根系表面积、直径、总长度、体积和根系分形维数,促进新梢生长和干径增粗,稻草苫和农用地毯的效果更显著。稻草苫改善根系生理特性和根系形态构型,提高夏秋季叶片Pn及促进植株生长的效果最突出;农用地毯对根系分形维数的提高与稻草苫相近且高于园艺地布和透明塑料膜,对根系生理变化的稳定作用最突出;园艺地布对夏秋季叶片Pn的提高作用仅次于稻草苫,对根系生理参数的稳定效果不及农用地毯;透明塑料膜在夏末和中秋季节降低根系活力,对秋季叶片WUE的提高及对植株生长的促进作用最小,对根系生理变化的稳定作用也最小。【结论】从改善苹果根系活力和根系构型、提高叶片光合作用和水分利用效率、促进植株生长及稳定根系生理变化的综合效果看,稻草苫的覆盖效果最好。     

苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定

【目的】分离苹果生长素响应因子MdARF5（Auxin Response Factor 5）,分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示MdARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果（Malus×domestica ‘Royal Gala’）为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF（Auxin Response Factor）转录因子,并将其命名为MdARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析MdARF5对MdMYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子MdARF5（序列号：MDP0000143749）,该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果MdARF5与梨PbARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达MdARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明MdARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个MdARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,MdARF5能够抑制MdMYB1的表达。【结论】推测苹果MdARF5可能通过直接抑制MdMYB1的表达负调节花青苷的积累。     

苹果中4种常用农药残留及其膳食暴露评估

【目的】对国产苹果中多菌灵、甲基硫菌灵、吡虫啉和灭幼脲4种常用农药残留及其膳食暴露进行评估,明确并量化中国居民食用苹果途径的上述4种常用农药膳食摄入风险水平,为苹果安全生产、消费及质量安全监管提供依据。【方法】基于渤海湾（辽宁、山东、河北）和西北黄土高原（陕西、山西、河南）两大苹果优势主产区采集的282份苹果样品,运用专业风险评估软件@Risk,尝试构建非参数概率评估模型,对中国居民食用苹果途径的农药膳食摄入（暴露）风险进行概率评估。首先对282份苹果样品中上述4种农药残留检测值进行分布拟合,拟合度运用Chi-Squared、Anderson-Darling、Kolmogorov-Smirnov 3种统计方法进行检验,综合考虑3种评估拟合结果,确定最佳拟合分布。STMR、HR取最佳分布拟合值,%ADI和%ARfD分别表示慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险。【结果】参试的282份苹果样品,255份（占90.4%）苹果样品中检出了农药残留。在检出的4种常用农药中,多菌灵的检出率最高,达到81.9%;其次为甲基硫菌灵和吡虫啉,分别为52.1%和39.0%;灭幼脲的检出率最低,仅为31.2%。绝大多数苹果样品中农药残留量处于较低水平,最大检出浓度为0.9251 mg·kg^-1（多菌灵）,但仍远低于最大残留限量值3.0 mg·kg^-1。样品中4种常用农药残留量均值依次为多菌灵（0.1042 mg·kg^-1）＞灭幼脲（0.0182 mg·kg^-1）＞甲基硫菌灵（0.0082 mg·kg^-1）＞吡虫啉（0.0050 mg·kg^-1）。样品中4种常用农药残留量离散程度有异,变异系数分别达到232.8%（甲基硫菌灵）、214.8%（吡虫啉）、174.1%（灭幼脲）和136.4%（多菌灵）。282份苹果样品农药残留量分布规律较明显,随着农药残留浓度的升高,样品所占的比例均呈逐渐降低的趋势。27份（占9.6%）苹果样品中未检出上述4种常用农药,198份（占70.2%）苹果样品中检出2种及以上农药残留,19份（占6.7%）苹果样品甚至检出4种农药残留。不同年龄组人群食用苹果途径的上述4种常用农药慢性膳食摄入风险（%ADI）分别为0.2120%-35.1100%（多菌灵）、0.0051%-0.8240%（吡虫啉）、0.0049%-0.1710%（甲基硫菌灵）和0.0004%-0.0152%（灭幼脲）;急性膳食摄入风险（%ARfD）分别为0.1940%-16.0500%（多菌灵）和0.0122%-0.9400%（吡虫啉）。幼儿（2-6岁）和儿童（7-13岁）2个年龄组人群由于体重较轻,而苹果摄入量相对较高,膳食摄入风险明显高于其他年龄组人群,为重点监控对象。不同年龄组人群之间,随着年龄的增加,农药膳食摄入风险整体呈逐渐下降趋势;同一年龄组人群,选取的百分位点值越高,农药膳食摄入风险越大。【结论】中国苹果中多菌灵、甲基硫菌灵、吡虫啉和灭幼脲这4种常用农药检出率较高,但所有样品农药残留量均低于最大残留限量。中国居民食用苹果途径的上述4种常用农药慢性和急性膳食摄入风险均很低,幼儿和儿童2个年龄组人群膳食摄入风险明显高于其他年龄组人群,需重点关注。     

不同来源苹果茎沟病毒分离物部分序列分子特性研究

[目的]明确为害新疆不同品种梨的苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV)侵染状况,并对获得的病毒基因序列进行分子鉴定.[方法]采用生物学和分子生物学方法对来源于新疆梨、砂梨及红梨上的ASGV进行检测,将获得基因序列进行比对分析.[结果]从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 by的ASGV扩增产物.对扩增产物进行克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核昔酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2;-100;和95.6;-100;,CP基因核苷酸序列构建系统发育树显示,来源于库尔勒香梨分离物KII-3、KII-5、KII-7和新梨7号的分离物XII-5、XII -6,与早期已报道的库尔勒香梨分离物KRL-1及砂梨分离物P-6-1-17亲缘关系较近,聚集成簇.此外,库尔勒香梨的分离物KII-10、KII-14及新粱7号的分离物XII-10与云南红梨上2个分离物YN-2和YN-4聚集成簇,遗传距离较近.[结论]CP基因核昔酸序列系统发育树显示,来源于新获不同品种梨的8个ASGV 分离物及红梨上3个ASGV分离物位于两个不同的组群,存在复杂遗传变异现象.     

苹果MADS-box转录因子的生物信息学及其在不同组织中的表达

【目的】分析已知苹果（Malus×domestica）MADS-box基因基本信息,研究其在不同组织中表达情况。【方法】利用NCBI数据库查询并获得苹果MADS-box基因,采用CLC Combined Workbench version 6、WebLogo 3、MEGA4.1、MapInspect和MEME等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术研究MdMADS基因在不同组织中的表达情况。【结果】共得到26个苹果MADS-box基因。MADS-box结构域分析显示,氨基酸10（I）、16-19（RQVT）、22-23（KR）、29-31（KKA）、33（E）、37-39（LCD）、42（V）和48（S）是保守不变的。保守元件分析表明,苹果MADS-box基因包含4个保守元件：元件1、3为MADS盒;元件2、4为K盒。所有苹果MADS-box蛋白都包含有MADS盒（除MdMADS9）和K盒。进化树分析结果显示,苹果MADS基因共分为5个亚组。MdMADS1、3、4、6、7、8、11、18属于SEP亚组;MdMADS2、5、12属于AP1亚组;MdMADS10、14、15、19、22和MdAGL属于AG亚组;MdMADS16、17、21、MdSOC1、MdSOC1a和MdSOC1c属于SOC1亚组;MdMADS13、23和MdPI属于AP3亚组;MdMADS20属于SVP亚组。染色体定位分析显示,MdMADS在8号染色体上分布最多,共有4个;其次是染色体2、14和17,均分布3个;染色体1、5、6、7、11和16均分布1个;染色体3、4、12和15则没有分布。RT-PCR结果分析显示,SEP和AGL亚组表达模式较为一致,主要在花和果实中表达;AP1亚组除在花和果实中表达外,在其它组织器官中也有表达。【结论】苹果MADS-box基因结构高度保守,多数成员参与调控花和果实发育过程。     

长期继代培养的转基因苹果外源基因遗传及表达稳定性分析

为研究长期继代培养的转基因苹果组培苗中外源基因的遗传及表达稳定性,以继代培养9年的7个转GFP(绿色荧光蛋白)基因苹果株系组培苗为试材,分析转基因株系对Kan(卡那霉素)的抗性、DNA水平、转录水平和转录后水平GFP基因的遗传及表达稳定性。结果表明,在7个苹果转基因株系组培苗中均可检测出GFP特异基因片段,并且均可在含有50 mg/L卡那霉素的培养基上正常生长;绝对定量qRT-PCR检测发现,各转化株系GFP基因拷贝数并不相同;利用相对定量qRT-PCR法检测发现7个株系中GFP基因 mRNA表达量有明显差异,同时荧光显微镜下观察各转化株系叶片,绿色荧光强度有明显差异,利用SPSS软件对7个转基因株系中GFP基因拷贝数与GFP mRNA表达量相关性分析结果呈无显著相关性。以上结果表明,外源基因可以在长期继代培养的转基因苹果组培苗中保持其遗传稳定性,但不同转化株系中外源基因的表达量有显著差异,其表达量与拷贝数无显著相关,可能与外源基因在植物基因组中的插入位点有关。     

苹果砧木脱落酸与树木生长规律的研究

用气象色谱法分析了苹果矮化砧木和乔化砧木5月10日～11月10日叶片内源脱落酸(ABA)的含量水平。结果表明:(1)矮化和乔化砧木叶片内ABA含量以相似的规律变化着,其内在变化影响树体新梢生长、幼芽发育及落叶等生长环节,(2)矮化砧木的ABA含量水平始终高于乔化砧木,通过对M,S和SH系的相关分析,表明树体叶片的ABA含量水平与树体高度、树干周长及新梢长度均呈显著负相关。     

蒲桃胚胎发育及多胚来源的初步研究

观察了蒲桃花果的形态结构和胚胎发生.蒲桃胚囊的发育属蓼型.每个蒲桃子房内有10多个胚珠,但成熟果实内多数只有1粒种子,少数为2粒,原因为一些胚囊不能发育成熟,而那些成熟的胚囊又有一部分不能顺利地完成双受精.蒲桃胚乳发育属核型.在受精之前,多数珠心的表皮下即有珠心胚原细胞出现,这些细胞分裂成为不定胚的原始体.随着某些珠心内的胚囊败育,这些不定胚原始体也归于消亡.而那些顺利完成双受精的胚囊外的不定胚原始体则可往胚囊方向靠拢,并进一步侵入胚囊.通常,侵入胚囊的珠心胚达5—9个.此外,也观察到了裂生多胚现象.最终,每粒发育成熟的种子内存有2-10个胚,合子胚、裂生胚和珠心胚混杂在一起.