禽流感病毒A/Duck/Shnghai/02/99(H9)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank已公布的禽流感病毒H9亚型血凝素蛋白编码基因,设计了一对引物(H1和H2),RT-PCR扩增禽流感病毒A/Duck/Shanghai/02/99(H9)的HA基因,扩增片段与载体pUCm-T的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,重组质粒pUCm-T-HA经限制性内切酶酶切和PCR鉴定后进行测序。BlastN分析结果显示该分离株血凝素编码基因与已发表的鸭源禽流感病毒A/Duck/Shantou/1605/01(H9N2)和A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)血凝素编码基因的核甘酸序列同源性为98%,从而从分子水平确定了该分离株为H9亚型禽流感病毒。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

细菌阿特拉津氯水解酶基因的功能及其应用

简要介绍了能降解除草剂阿特拉津的细菌的种类和它们的生物降解途径、阿特拉津氯水解酶的功能和定向进化的研究进展,以及阿特拉津氯水解酶基因atzA在污染土壤生物修复和转基因植物研究中的应用。     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT—PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N禽流感病毒毒株（HB2002）中克隆到血凝素基因（HA）序列,该克隆基因全长1714hp,提交GenBank,获得登录号DQ285546。同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A／duck／Hainan／4／2004（H6N2）,A／duck／HongKong／3600／99（H6N2）毒株有99％的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近。由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB2002为低致病性禽流感病毒．     

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

 对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV 分离物为另一组。以RSV-CXi分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。     

SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的表达及免疫原性分析

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化

将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。     

Molecular Markers for Leaf Rust Resistance Gene Lr45 in Wheat Based on AFLP Analysis

Amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis was carried out in Thatcher, near isogenic lines (NILs) carrying different genes conferring resistance against wheat leaf rust, and TcLr45 x Thatcher F₂ progenies were used to develop markers for Lr45 gene. Sixty AFLP primer combinations were screened and most of them provided clear amplification products, 31 primer combinations displayed polymorphism of TcLr45 in 23 NILs. Two AFLP markers closely linked to the gene Lr45 were acquired: P-AGG/M-GAG_{261 bp}, which was found closely linked to the Lr45 locus at a distance of 0.6 cM on one side, and P-ACA/M-GGT_{105 bp}, which was found at a distance of 1.3 cM on the other side. The specific bands were cloned and subsequently sequenced. The 261-bp fragment produced by P-AGG/M-GAG showed 86% similarity with the sequence of Vulgare Hart I gene; the 105-bp fragment produced by P-ACA/M-GGT showed 96% similarity with the phosphatidylserine decarboxylase gene of the Triticum monococcum. Both included an open reading frame (ORF).