枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰阳性细菌,内生芽孢,其分布非常广泛,在土壤、湖泊、海洋、动植物体表等处皆能发现。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,因其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色添加剂,故具有广阔的发展前景,并在饲料添加剂、污水处理、生物农药、疫苗载体等各方面已经得到了广泛的应用[1-3],显示了巨大的社会效益和生态效益。试验自土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌,并对该菌株进行了鉴定,旨在为枯草芽孢杆菌基因功能的研究以及进一步开发利用奠定基础。     

中草药对细菌耐药质粒的消除作用研究

动物养殖中常见病原菌对抗菌药物的耐药性呈逐年上升的趋势,引起了广大科研工作者的极大关注。病原菌耐药性的产生主要与质粒有关,质粒能够将耐药基因传递给环境中的其他细菌,进而引起多重耐药菌株的出现。本文就细菌耐药现状、细菌耐药性与质粒关系、中草药对细菌耐药质粒的消除效果、中草药消除耐药质粒的机理、存在的问题、中草药对耐药质粒消除的展望这些方面进行简单综述。     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术，将用PCR扩增来的VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体pBin438中，成功构建了重组表达质粒pTh—VP4-ST和pB—VP4ST。将pTh—VP4-ST进行SDS-PAGE分析，结果表明，表达的目的蛋白以包涵体形式存在，大小约40ku；同时将pB—VP4一ST转化了农杆菌EHA105。     

旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选，对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明，WN1 cDNA全长为474bp，含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由117个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为13200，等电点为4．25，N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示，此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a，重组质粒经鉴定后，转化大肠杆菌BL21 star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白，与理论设计完全相符。     

大肠埃希菌质粒DNA提取方法的优选

采用酚/氯仿少量提取法、异丙醇沉淀法、煮沸法以及微波炉法提取细菌质粒,然后分别对各种方法所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析,并用紫外分光光度计测定其OD值,对其优劣性进行全面的分析.结果表明,异丙醇提取法所提取的质粒DNA纯度和产量高(其DNA片段荧光较强,具有清晰的亮带,OD260/ OD280约为1.77,DNA样品浓度约为195 μg/mL),且重复性好,具有结果稳定的特点,达到了分子生物学试验要求,适合大多数实验室使用.     

猪轮状病毒国内分离株JL94 VP7基因克隆与真核表达质粒的构建

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94。利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插入pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T-JL94/VP7,并对其进行了HindⅢ，HindⅢ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明pMD18-T-JL94/VP7的插入基因为轮状病毒的VP7基因。重新设计一个带有Kozak序列的上游引物，通过PCR扩增出带有Kozak序列的vp7基因并将其插入pMD18-T载体中构建了重组质粒pMD18-T-VP7,酶切鉴定其大小和方向后，与真核表达载体pcDNA3.1( )分别用HindⅢ和BamH I双酶切，胶回收纯化后连接。经酶切和核苷酸序列检测鉴定，成功地构建了真核表达质粒pcDNA-VP7。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按10³～10⁷拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r²=0.998、r²=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(10⁷拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

DNA疫苗在猪病防制中的研究应用及其优缺点分析

一、DNA疫苗的免疫机理DNA疫苗(DNA vaccine)又称基因疫苗、核酸疫苗,由病原抗原编码基因及质粒载体两部分组成。抗原基因可以是单个基因或完整的一组基因,也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列,质粒载体可在真核细胞中表达外源基因。DNA疫苗是将编码目的抗原蛋     

河南省鸡源致病性大肠杆菌耐药性的监测分析

对来源于河南省32个县市的93株鸡源致病性大肠杆菌进行了16种抗生素药物的药敏试验和菌株耐药性与质粒图谱间关系的分析研究。结果表明:93株鸡源致病性大肠杆菌均为多重耐药菌株,耐药种类3～14种,耐药图谱复杂,可以分为58种耐药类型,相同来源的大肠杆菌耐药图谱、质粒图谱相似,但菌株耐药种类与质粒图谱条带的多少无一定的相关性。     

中药复方对猪场大肠杆菌病的治疗效果及对耐药质粒的消除作用

细菌的耐药性一直是专业人员研究的热点和世人关注的焦点。细菌耐药性主要由耐药质粒介导,从本文结果看,中药复方必须使细菌耐药质粒得以消除,才能使细菌恢复对抗生素的敏感性。中医药具有毒副作用小、无残留等优势,在细菌耐药性消除研究中具有重要的研究价值。