大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

猪圆环病毒2型BF株ORF2基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR从构建的猪圆环病毒2型／(PCV2)ORF2重组质粒(pGEM-T-ORF2）中扩增出大小为593bp的ORb2基因，克隆到表达载体pET-32a，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量40kD，表达量20％左右。经Western blot检测，重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻 T-DNA旁邻序列的效率比较

获得突变体中T-DNA的旁邻序列是通过反向遗传学进行功能基因研究的重要手段。实验比较了用质粒营救法和TAIL-PCR法获得T-DNA在水稻(Oryza sativa）基因组中旁邻序列的效率。利用质粒营救法获得T-DNA在水稻中的旁邻序列效率可高达900左右，而利用TAIL-PCR法的效率只有62％。质粒营救法和TAIL-PCR法获得的旁邻序列中水稻基因组DNA的效率分别是80％左右和89％左右。根据实验结果，质粒营救法从转基因植株获得的旁邻序列，水稻基因组DNA的效率是72％，比TAIL-PCR法高18％。     

发根农杆菌Ri质粒转化康乃馨初步研究

利用具有Ri质粒的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Pri15834对康乃馨组培苗的带叶茎节进行转化试验。转化后的外植体在K0附加500mg/L羧苄青霉素培养基上培养2～3周后，受感染的伤口部位长出无向地性的毛状根，频率为37.07%。将毛状根切碎分别在K0、K1、K2培养基上继续培养3周，毛状根在K0上表现为无限生长，在K1上主要表现为长愈伤组织，频率为51.42%，而在K2上则主要表现为长绿苗，频率为25%。这说明发根农杆菌的Ri质粒已整合到康乃馨细胞基因组中并得到表达。     

种鸭大肠杆茵性生殖器官病的研究——5.鸭生殖道大肠杆菌质粒指纹图谱分析

本文报导了对四川九个县1987年至1989年爆发流行鸭生殖道大肠杆菌病的89株菌的质粒指纹图分析。结果表明:同一来源的菌株具有完全相同或基本相同的PP和酶切图谱,不同来源菌株也共同具有1—2条质粒带和酶切片段,并与正常鸭肠道大肠杆菌的图谱有差异。这提示这次爆发流行的鸭生殖道大肠杆菌病是由少数几株在遗传学上具有高度同源相关性的菌株引起。本文也说明质粒指纹图谱法为一快速、简单、有效、特异性强的流行病学研究工具。     

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。     

几株生产用小单孢菌质粒DNA的分离、鉴定和功能的研究

以庆大霉素生产菌--绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea, M.p), 小诺霉素、庆大霉素生产菌--棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora, M.e)和西索霉素生产菌--伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis, M.i)为研究材料, 对其遗传性状特别是质粒DNA进行了分离、鉴别并对其功能进行了研究. 结果表明: 三株生产用小单孢菌质粒DNA与该菌产生孢子、色素有关, 而与产生抗生素无关. 说明这三株生产用小单孢菌产生抗生素的基因在染色体DNA上, 从而为研究、改造这三株生产用小单孢菌染色体DNA遗传性状和提高产量奠定了基础.     

含GFP报告基因的伪狂犬病病毒上海株gE-gI基因部分缺失株的构建

在伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上，进一步构建了转移载体质粒，为PRV－SH的gE－gI基因部分缺失毒株的构建作准备，将gI和gE基因克隆入pUC18中构建pgEI载体，利用gE基因中的酶切位点缺失掉gE基因5′端363bp，并把录色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分。通过酶切鉴定，表明GFP基因已3插入到pgEI中，构建了含GFP的缺失转移载体pgEI-GFP。用DOTAP试剂将pgEI-GFP转染感染了PRV－SH株的兔肾（RK）细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，并以GFP为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒，命名为PFDE／DI。     

转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910,扩展标准不确定度（K=2）为0.013。     

基因枪法获得转基因小麦植株

 利用适用于禾谷类作物的表达载体 pGU4ABBar,采用基因枪法 ,将人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cryIa导入小麦品种扬麦 15 8,经PCR和Southernblot鉴定 ,证明获得 4株导入cryIa基因的小麦转基因植株 ,转化率约为 0 .7% ,并通过Westernblot鉴定检测到了目的蛋白的表达。