FMDV P1基因DNA疫苗构建及免疫实验

[目的]构建口蹄疫DNA疫苗[方法]构建以PRV为载体的表达FMDV P1基因的质粒pIESZP1和pUTK3CP1,免疫小鼠并检测了免疫后小鼠的抗体水平.将构建的2个真核表达质粒分别转染Vero细胞,通过PCR、IFA、Western-blot等方法检测目的基因的转录和表达.将正确表达目的基因的DNA质粒肌肉接种3周龄的Balb/C小鼠,采用ELISA和SN方法检测了免疫小鼠体内的抗体水平.[结果]携带有FMDV衣壳蛋白P1基因的DNA质粒能引起小鼠产生特异性的体液免疫反应,两重组质粒诱导小鼠产生抗FMDV的抗体水平无差异.[结论]该研究为含有FMDV P1基因重组PRV以及重组病毒的动物免疫试验以评价基因工程疫苗的免疫效果奠定了基础.     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离鉴定与特性分析

我国从2017年4月30日起禁止将黏菌素作为动物促生长剂使用,为评估禁用政策效果,并了解畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌对临床常用药物的耐药情况,在2017年和2020年分别从长春市3个畜禽养殖场采集373份粪便样品分离鉴定出546株耐黏菌素大肠埃希氏菌。分离菌株对黏菌素的MIC为0.25 mg/L～8 mg/L,2020年MIC≥2 mg/L菌株分离率(18.02%)低于2017年(26.24%);16种药物敏感性测定中,2017年和2020年均以耐4种抗生素占比最高,2020年多重耐药菌株占比(60.25%)低于2017年(80.85%);PCR鉴定出34株mcr-1基因阳性菌株,2020年mcr-1基因检出率(3.21%)低于2017年(14.89%);2017年mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌中检测到12种类型质粒,2020年mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌中检测到7种类型质粒,携带的质粒类型减少。结果表明,禁止黏菌素作为饲料添加剂使用后对大肠埃希氏菌的黏菌素耐药性有很大的影响,但多重耐药情况依然较严重,携带质粒复制子复杂多样,应当持续进行监测。     

CpG ODN重组质粒对猪外周血淋巴细胞免疫刺激作用的研究

为获得对猪具有免疫刺激活性的含CpG序列的重组质粒,设计合成了11条CpG序列,应用MTS比色法测定合成CpG ODNs刺激猪PBMC增殖的能力,结果有10条CpG ODN对猪PBMC具有刺激活性(SI>2);以对猪PBMC具有较高刺激活性的CpG06和CpG08为核心,分别合成含6次重复序列的重组质粒pCpG06和pCpG08,并检测其对猪PBMC的刺激活性,结果重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC的刺激指数分别可达4.97和5.32,并可刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4。研究获得的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性,可为猪用CpG佐剂的研究提供参考。     

转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

标准物质具有特定量值、均匀性和稳定性三大典型特征,也是其作为测量标尺的依据.转基因生物标准物质是我国转基因产品标识制度顺利实施的关键技术支撑之一.文章以转基因玉米TC1507为对象,制备了转化体特异性的新型质粒DNA标准物质pTC1507,并对其均匀性、稳定性、量值进行了评价和测定.测试结果表明,制备的质粒DNA标准物...     

一种简便快速的体外点突变方法

体外点突变是研究蛋白质结构 -功能关系、基因表达、载体修饰等的重要技术之一。已报道的一些体外突变方法 [1～ 4 ] ,一般需以单链 DNA为模板 ,并要求对突变基因进行亚克隆和对单链 DNA拯救 ,技术上较复杂 ,多数需 1周以上时间。Stratagen公司研制的 Quickchange试剂盒 ,可以双链 DNA质粒为模板 ,只需 4步操作 ,在 1～ 2 d内即可完成点突变过程 [5] ,但该试剂盒价格昂贵 ,使用次数有限。我们根据 Pfu和 Dpn 等酶的特性 ,自行设计了突变反应及方法 ,对 6kb、8kb和1 4.6kb的目的质粒分别进行了点突变 ,成功地在质粒上创造了相应的酶切…     

动物钙营养代谢的基因调控探讨

钙是动物体内必需营养元素之一,钙代谢直接关系到畜禽生长和生产潜力的发挥。随着生产性能的大幅提高,因钙代谢引发的相关疾病或问题日益突出,本文从钙的吸收排泄、机体内自主代谢调节及基因调控等方面,对动物钙营养代谢的基因调控进行了分析探讨。     

miR-144表达质粒的构建及其对肝癌细胞生物学行为的影响

【目的】构建microRNA-144(miR-144)的真核表达质粒,并探讨miR-144对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响,为肝癌的生物学治疗提供依据。【方法】构建miR-144真核表达质粒并合成miR-144反义寡核苷酸,通过实时定量PCR检测miR-144的表达,采用MTT比色法及流式细胞仪技术,检测抑制与过表达miR-144对肝癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。【结果】成功构建了miR-144的真核表达质粒,过表达miR-144能够显著抑制肝癌细胞的增殖(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05);而抑制miR-144的表达则得到相反的结果;抑制与过表达miR-144对肝癌细胞周期的影响都不大(P>0.05)。【结论】miR-144能影响人肝癌细胞株HepG2的生物学行为,具有抑制肝癌细胞增殖的作用。     

p15基因真核表达重组体及人宫颈癌细胞转染的研究

将含人p15cDNA质粒pBS-SK-p15以EcoRI和XhoI进行双酶切，再与真核表达载体pCR^TM3经相同酶切点连接，转化感受态细菌，筛选，鉴定得到可在真核细胞中表达人p15基因的重组质粒PCR-hp15。以脂质体介导法转染人宫颈癌细胞，用G418筛选，得到转染的人宫颈癌细胞，转染细胞的恶变程度有所改善。