亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的促进作用

为了分析亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的影响,本试验建立了以大肠杆菌(E.coli)J53作为受体菌,携带RP4-7质粒的E.coli DH5α和携带mcr-1阳性IncI2质粒的临床菌株E.coli LD67-1为供体菌的接合转移模型,测定亚抑菌浓度的万古霉素对接合转移的影响,并通过细胞膜通透性检测、扫描电子显微镜观察、活性氧(ROS)检测和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法探究其内在机制。结果显示,与空白对照组相比,亚抑菌浓度万古霉素可显著提高RP4-7质粒和mcr-1阳性IncI2质粒的接合转移频率(P<0.05);N-苯基-1-萘胺(NPN)和碘化丙啶(PI)探针检测显示,亚抑菌浓度万古霉素可使受体菌细胞内、外膜通透性增加,供体菌细胞外膜通透性增加;扫描电子显微镜观察显示,经1/4最小抑菌浓度(MIC)万古霉素处理后接合细菌细胞膜发生损伤;ROS检测结果显示,与空白对照组相比,虽然经1/4 MIC万古霉素处理的受体菌的ROS表达水平显著上调(P<0.05),但1/8 MIC万古霉素处理后,供体菌和受体菌的ROS水平均无显著变化(P>0.05);RT-q...     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。     

可定点整合的无筛选标记LacS基因表达载体的构建与鉴定

试验旨在构建一个能够定点整合且无筛选标记基因的半乳糖苷酶基因LacS表达载体.本研究以pEGFP-N1质粒为原始框架,通过PCR及限制性酶切位点在pEGFP-N1质粒的标记基因两端添加两个同向LoxP序列,在多克隆位点上游添加能够定点整合的attB序列,最后再将目的基因BC promoter-LacS-PolyA通过限制性酶切位点插入多克隆位点.每一步都进行PCR、酶切及测序鉴定.PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果也与相应寡核苷酸序列一致,证明各个基因片段正确地连接到载体相应位置.本试验成功构建了可定点整合的无筛选标记半乳糖苷酶基因表达载体pEGFP-N1-LacS.     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

骨骼肌电穿孔转基因技术研究进展

目前,在大动物模型试验中,骨骼肌电穿孔转基因技术已被广泛用于转染一些功能基因,并能显著提高非病毒载体基因的转染效率。笔者就电穿孔促进基因通过细胞膜的可能机理及影响骨骼肌电穿孔转基因效率的关键因素（如物种、细胞直径、场强、脉冲参数、电极和电脉冲仪等）进行了综述。     

猪圆环病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的构建及分子佐剂联合免疫研究

用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因ORF2,同时人工合成一段CpG序列,并设计上下游引物,进行扩增,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建新型核酸疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-ISS),并进行了酶切和测序鉴定.用构建的pcDNA-PCV-ORF2-ISS质粒以及pcDNA-PCV-ORF2与5种细胞因子分子佐剂质粒(IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ真核表达质粒)联合对仔猪进行免疫试验.免疫后用间接ELISA法测定猪圆环病毒Ⅱ型特异性抗体IgG,用流式细胞仪测定猪血液CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚类的数量.结果显示,成功构建含CpG免疫刺激序列的猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗;pcDNA-PCV-ORF2-ISS在仔猪免疫实验能诱导细胞免疫并产生特异性抗体(P<0.05);用5种细胞因子分子佐荆质粒与pcDNA-PCV-ORF2疫苗同时免疫能显著提高DNA疫苗的免疫效果(P<0.05).分子佐剂免疫增强效果次序为:IL-6、CpG、IL-6/4、IL-2、IL-4和IFN-γ,表明IL-6和CpG最佳.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建

本实验根据PRRSV结构蛋白的特性和IFNγ及IL-2这两种细胞因子的特性,构建表达PRRSVGP4-GP5、GP5-M、GP5-N、GP5-IFNγ、GP5-IL-2、N-IFNγ、N-IL-2的重组质粒。这些重组质粒在真核细胞中得到了表达。用这些真核表达质粒可以免疫小猪,通过检测其对猪体免疫应答的诱导能力和接种后动物对PRRSV的抵抗力来对基因疫苗的效能进行研究,以期筛选到有效的基因疫苗并为今后进一步的研究提供思路和理论基础。     

乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化

[目的]建立一种简便、快速、安全的乳酸乳球菌质粒提取方法.[方法]质粒提取采用文献报道的乳酸菌质粒提取与常用的大肠杆菌质粒提取相结合的方法,并对提取过程中溶菌酶浓度、溶菌酶处理方式和时间进行优化.[结果]采用改良后的方法提取乳酸菌质粒效果显著.最佳溶菌酶浓度是10 mg/mL,最佳溶菌酶处理方式和时间是37℃振荡培养30 min.[结论]该方法避免了毒性物质溴化乙锭的使用,同时减少了通常提取乳酸菌质粒的复杂步骤,是一种高效、快速、安全的提取乳酸菌质粒的方法.     

几种内生真菌DNA提取方法的比较

通过三种内生真菌DNA提取方法的比较,即CTAB法、SDS法、改良的CTAB法,结果表明三种方法都能得到目的DNA,而且得率都不错,但改良的CTAB法效果最好,DNA纯度高且质量也好。用改良的CTAB法所提取的DNA作为模板,进行PCR扩增,得到了清晰的单一的扩增普带,完全可用于酶切、测序等后续实验。