一种测定水稻白叶枯菌基因组中插入序列IS1112拷贝数的定量PCR方法

建立了以标准质粒为基础的测定水稻白叶枯基因组中插入序列IS1112拷贝数的TaqMan实时荧光定量PCR方法。通过重叠PCR方法扩增了由16S rDNA基因与插入序列IS1112的部分片段组成的重组片段,连接到载体pMD18-T上,构建了标准质粒。利用该标准质粒建立的定量方法测定了我国12种白叶枯菌株基因组中IS1112的拷贝数。     

衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

提取衣藻总 DNA,以此为模板并参照肌动蛋白基因编码区端的序列合成寡聚核苷酸引物,进行聚合酶链式反应,扩增到一个1.2 kb 的 DNA 片段.将此片段进行克隆并经分子探针杂交,证明此片段为衣藻肌动蛋白基因.经限制性核酸内切酶处理,构建了衣藻肌动蛋白基因的物理图谱.根据物理图谱进行亚克隆以后,测得了编码区5′端的618个核苷酸的顺序.衣藻肌动蛋白基因的编码序列与高等植物之间的同源性大于90%,高于与高等动物、原生动物及真菌的同源性.但在基因的结构上,衣藻肌动蛋白基因又明显地不同于高等植物,在已经测定的基因片段上,没有发现内含子的存在.经限制性内切酶片段多态性分析,衣藻中含有一个肌动蛋白基因拷贝.     

实时荧光定量PCR技术在检测外源基因拷贝数中的应用

通过对PCR法、Southern Blot法、IPCR法与实时荧光定量法4种转基因外源基因检测方法的比较认为:PCR扩增虽十分灵敏,但有时会出现假阳性扩增,因而对外源基因是否整合还需进行验证.Southren方法准确性高,特异性强,但存在费时、费力的缺点.同时实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后,一般都比较细弱,不宜大量取样.IPCR法虽可以转座突变分离基因,但当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T DNA整合到染色体中引起插入突变并分离基因造成误差.实时定量PCR技术的特异性和高信噪比为转基因拷贝数定量提供了方便,实时定量PCR法,花费试剂少、节省劳力和时间,需要DNA样品量少、并不进行放射检测.同时对实时荧光定量PCR法计算进行了详细介绍.     

拷贝数变异在畜禽育种中的研究进展

拷贝数变异（copy number variation,CNV）是1种重要的遗传变异方式,目前已在人类及许多模式动物中筛查到与重要性状存在相关性的CNV,这为研究畜禽重要经济性状及疾病的致病机理提供了参考依据。文章参考国内外相关研究报道,对包括牛、羊、猪、鸡在内的4种畜禽CNV研究现状进行综述,并对CNV的应用前景进行展望,旨在为实现CNV在畜禽育种中发挥更大作用提供参考。     

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术在天然蛋白表达方面应用广泛，常用的噬菌体表面展示系统主要有：丝状噬菌体、入噬茴体和T4噬茸体等，目前用的较多的是T4噬菌体。T4噬菌体结构较大．遗传结构复杂．具有容量太、拷贝数高，可以展示的多肽或蛋白质范围广等优点，目前已经有多种蛋白采用T4噬茼体展示系统得到了表达。     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。     

多聚酶链反应区分血清Ⅰ型MDV强弱毒株

选用血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ＿１）基因组中位于１３２ｂｐ正向重复序列两侧的２段寡聚核苷酸为多聚酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对Ⅰ型ＭＤＶ强毒株（京－１株）和弱毒株（Ｍｄ１１／７５Ｃ株）的核酸进行基因扩增。结果显示：该弱毒株核酸基因中含６个或更多个拷贝数的１３２ｂｐ正向重复序列，而强毒株核酸基因中仅含２个，相同引物对Ⅱ型、Ⅲ型ＭＤＶ（ＳＢ－１株，Ｆｃ１２６株）和禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）核酸作ＰＣＲ扩增，未检出任何核酸片段。     

内共生菌Sulcia muelleri与Sodalis sp.在大青叶蝉中的分布

【目的】探明大青叶蝉不同发育历期和组织器官中Sulciamuelleri和Sodalis sp内共生菌的分布,为利用内共生菌对大青叶蝉进行生物防治提供参考。【方法】设计内共生菌S.muelleri和Sodalis sp.的16 SrDNA的特异引物,检测在大青叶蝉不同发育历期的感染情况;同时利用绝对定量PCR对大青叶蝉不同发育历期和成虫组织器官中2种内共生菌的拷贝数进行检测。【结果】大青叶蝉的卵、若虫、雌雄成虫均感染了S.muelleri和Sodalis sp,感染率均为100%;S.muelleri拷贝数在5龄若虫中最高,而Sodalis sp.的拷贝数在雌虫中最多,S.muelleri和Sodalis sp.拷贝数在卵中均最少。S.muelleri和Sodalis sp.拷贝数在菌胞组织中均较高,在雄虫和雌虫的唾液腺中较少。     

毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用

1)外源蛋白在酵母中表达受mRNA5′端和3′端的UTR序列的核苷酸序列及长度的干扰比较大。为保证外源蛋白的成功表达,目的基因5′端UTR应该与AOX1基因的mRNA5′端UTR尽量相似或保持一致。5′端UTR过长或过短都不利于外源蛋白的表达,因为过长或过短会影响核糖体40S亚单位的识别,只有在合适长度的5′端UTR的情况下才能保(上接第11期75页)     

蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成

<正>(续2015年第1期)3结果3.1 q PCR结果蜂群的来源对细菌数量没有显著影响,因此,来自不同群体的蜜蜂在后续分析中进行合并分析。工蜂日龄对BFG丰富度具有很大的影响,主要是由于NEWs采集于1日龄,几乎没有BFG种系型,只有较少的104个拷贝,而成年工蜂的16SrRNA基因的拷贝数可达