利用半定量PCR方法分析中国地方猪种内源病毒序列拷贝数的多态性

研究采用PCR方法检测了我国地方猪种内源病毒的拷贝数 ,希望能够找到拷贝数低或无内源病毒的个体或品种 ,培育一个适用于异种器官移植的品种或品系。共检测了 1 1个品种、2 60个个体 ,贵州猪、五指山猪、巴马猪的内源病毒拷贝数相对较低 ,分别为 34 61± 1 9 0 9、2 9 1 9± 1 3 47和 2 7 1 1± 1 4 46 ,膜蛋白A拷贝数分别为 9 33±6 40、1 0 0 4± 6 51和 1 0 56± 5 39,膜蛋白B拷贝数分别为 2 2 1 7± 9 2 0、2 1 0 0± 1 2 53和 2 1 86± 7 2 0。其他如二花脸猪、梅山猪、沂蒙黑猪、蓝塘猪等基因拷贝数相对较高 ;近交有造成内源病毒基因的拷贝数下降的倾向 ;另外民猪和香猪中分别有一头个体含有内源病毒 2个拷贝、膜蛋白A两个拷贝、膜蛋白B一个拷贝。中国地方猪种中内源病毒的拷贝数间差异较大 ,如进行大规模检测 ,可找到内源病毒基因拷贝数低或无内源病毒基因的个体     

植物基因组CNV研究进展及其对麦类作物相关研究的启示

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是作物基因组中广泛存在的一种遗传变异,与作物的适应性、抗逆性等许多重要农艺性状相关。本文主要就CNV的发生机制、研究方法,尤其是植物中CNV与表型、CNV与植物适应性进化、CNV与重要农艺性状的关联分析等方面的研究进展进行了概述,并就植物CNV的研究对麦类作物相关研究的启示进行了深入剖析,以期为我国麦类作物开展CNV相关研究提供参考信息。     

Absolute copy number differences of Y chromosomal genes between crossbred （Bos taurus x Bos indicus） and Indicine bulls

Background： The Y chromosome in mammal is paternally inherited and harbors genes related to male fertility and spermatogenesis. The unique intra-chromosomal recombination pattern of Y chromosome and morphological difference of this chromosome between Bos taurus and Bos indicus make it an ideal model for studying structural variation, especially in crossbred （Bos taurus x Bos indicus） bulls. Copy Number Variation （CNV） is a type of genomic structural variation that gives information complementary to SNP data. The purpose of this study was to find out copy number differences of four Y chromosomal spermatogenesis-related candidate genes in genomic DNA of crossbred and purebred Indicine bulls. Result： Four Y chromosomal candidate genes of spermatogenesis namely, sex determining gene on Ychromosome （SRY）, DEAD box po/ypeptide 3-Y chromosome （DDX3 Y）, Ubiquidn specific peptidase 9, Y-linked （ usPgY）, testis-specific protein on Y chromosome （TSPY） were evaluated. Absolute copy numbers of Y chromosomal genes were determined by standard curve-based quantitative real time PCR. Copy numbers of SRYand TSPYgenes per unit amount of genomic DNA are higher in crossbred than Indicine bulls. However, no difference was observed in DDX3Yand usPgYgene copy numbers between two groups. Conclusion： The present study demonstrates that the structural organization of Y chromosomes differs between crossbred and Indicine bulls which are reproductively healthy as observed from analysis of semen attributes. The absolute copy numbers of SRY and TSPY genes in unit mass of genomic DNA of crossbred bulls are significantly higher than Indicine bulls. No alteration in absolute copies ofDDX3Yand usPgYgene was found between the genome of crossbred and Indicine bulls. This study suggests that the DDX3Yand USPgYare likely to be single copy genes in the genome of crossbred and Indicine bulls and variation in Y chromosome length between crossbred and Indicine bulls may be due to the copy number variation of SRY gene and TSPYarray.     

人α-乳清蛋白转基因克隆牛外源基因拷贝数的分析

为了探讨转基因克隆动物外源基因拷贝数及拷贝数在传代过程中的变化,本研究应用实时荧光定量PCR检测人α-乳清蛋白(human alpha-lactalbumin,HLA)转基因克隆牛及其子代共5头牛中外源基因的拷贝数,其中K060923为亲代,172、081、189、隆娃为子代。HLA基因在亲代转基因克隆牛K060923中的拷贝数为1.145,在子代转基因克隆牛172、081、189和隆娃中分别为0.998、1.107、0.891和0.842。结果表明,5头牛中外源基因拷贝数都在1左右,说明人α-乳清蛋白基本以单拷贝形式整合到宿主基因组中,且稳定遗传。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR检测

为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数,基于实时荧光定量PCR法,建立通用、准确、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系,利用该体系成功检测了150个转基因柑橘单株系外源基因整合拷贝数。结果表明,转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝数为1,最高达5个,其中1、2和 ≥ 3拷贝的单株数分别占总数的40.0%、18.0%和42.0%;采用Southern blot技术进行检测,结果基本一致,极少数单株经实时荧光定量PCR分析的拷贝数比Southern blot检测的数值高。说明本研究建立的实时荧光定量PCR方法检测转基因柑橘外源基因整合拷贝数更加准确可靠。拷贝数为1 ~ 2的转基因株系可作为将来开展转基因目标性状研究及转基因生物安全性评价有利用价值的试验材料。     

5个猪品种3个拷贝数变异区的多态性分析

为了探究拷贝数变异(copy number variation,CNV)在不同猪品种间的多态性,本试验根据猪SNP60芯片检测结果,以大白猪、香猪、柯乐猪、糯谷猪、荣昌猪为主要研究对象,采用实时荧光定量PCR方法,对5个猪品种基因组中3个CNV区域(CNVR91、CNVR92和CNVR143)的拷贝数进行测定。结果显示,香猪的CNVR91以拷贝数缺失为主,其他4个猪品种的拷贝数以正常为主;香猪、大白猪、柯乐猪、荣昌猪的CNVR92以拷贝数缺失为主,糯谷猪以拷贝数正常为主;香猪和糯谷猪的CNVR143以拷贝数增加为主,其他3个猪品种以拷贝数正常为主。表明3个拷贝数变异区在5个猪品种之间具有多态性,可能通过剂量效应影响香猪、糯谷猪和柯乐猪等相关基因的表达和生理功能。     

转基因小麦B73-6-1外源基因拷贝数的确定

为了确定转基因小麦B73-6-1中外源基因HMW-GS的拷贝数,以期为HMW-GS基因的整合位点和遗传表达研究奠定基础,构建了含有外源基因HMW-GS的标准品,并以wx012基因作为内源参照,通过实时荧光定量PCR方法,进行了3次重复试验。结果表明,在3组试验中得到的HMW-GS基因分子数分别为8.62×1018、4.34×1018、1.10×1018个,wx012基因分子数分别为6.27×1017、3.14×1017、7.84×1017个,经计算HMW-GS基因拷贝数分别为13.75、13.84、14.01个,由此确定转基因小麦B73-6-1中HMW-GS外源基因的拷贝数为14个。     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

小麦TaCCaMK基因的研究初探

CCaMK作为一类重要的Ca2＋传感蛋白可以通过与胞内Ca2＋和CaM结合进而诱导下游蛋白质磷酸化方式以及基因表达模式发生改变。到目前为止,国内外已有几种高等植物的CCaMK被报道,但对小麦TaCCaMK基因的报道尚属空白。因此,本实验以5份不同倍性小麦为材料,对TaCCaMK基因的拷贝数以及TaCCaMK基因的视锥蛋白类结构域的单核苷酸多态性进行了初步的探讨,以便为TaCCaMK基因的深入研究奠定基础。