皱皮香猪3个基因组拷贝数变异的多态性分布

为探究皱皮香猪个体产生皮肤变异的根本原因,本文基于重测序数据,采用生物信息学分析皱皮香猪基因组中的拷贝数变异(CNV),通过荧光定量 PCR 方法检测皱皮香猪中 3 个 CNVs 的拷贝数变异规律,并与香猪和大白猪进行比较。结果表明:3 个 CNVs 在猪群中的拷贝数变异呈现出多态性变化,皱皮香猪中CNV1以拷贝数缺失型为主,其中的 MPC1和 RSK3基因可能与脂肪沉积有关;皱皮香猪 CNV2和 CNV3以拷贝数增加型占优势,其中的 CCL17和 CX3CL1基因参与皮肤等组织的炎症反应,可能通过剂量效应引起香猪皮肤产生褶皱。     

普通PCR试验应注意问题的探讨

普通PCR试验的原理是在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在Taq DNA聚合酶的作用下,经过高温变性、低温退火、中温延伸的     

表达猪圆环2型的多拷贝P28-Cap重组猪痘病毒的构建及表达量分析

为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型（PCV2）-Cap蛋白，插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系。本试验以猪痘病毒为载体，通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒，并纯化到了8株含不同拷贝数（1~8拷贝） P28-ORF2的重组猪痘病毒，基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断。纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41~384.96 μm，大小无明显差异。重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致。Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低；随着P28-ORF2拷贝数的增加，PCV2-Cap表达量也随之增加；至插入4拷贝P28-ORF2时，PCV2-Cap表达量达到峰值；随后减少。8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异，表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响。重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响。本研究结果表明，猪痘病毒为载体表达外源蛋白时，单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量，插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数。     

阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数实时定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。     

利用PTVA法提高超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

为得到高表达超氧化物歧化酶毕赤酵母工程菌株,促进SOD的产业化生产,将来源于蜡样芽孢杆菌M22菌株的Mn-SOD-2基因转入毕赤酵母GS115中,构建了表达工程菌株YS 1～100。采用PTVA法(Posttransformational vector amplification)进行拷贝数扩增处理。建立了SOD重组菌株MMH(Minimal Methanol+Histidine)平板简易检测法,使用该法对转化子进行初筛,并用荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)法检测部分重组酵母工程菌中外源SOD基因的拷贝数。结果表明:试验中得到80株高抗Zeocin的菌株YSP 1～80,经MMH平板法筛选得到菌株YSP14、YSP30、YSP48和YSP54的SOD酶活性明显高于处理前;菌株YSP54的SOD基因的拷贝数达到8个拷贝,而处理前仅为1个拷贝;Native-Page分析与NBT酶活性测定显示菌株YSP54发酵上清液中的SOD酶活性达到150U/mL,为处理前的2倍。提高毕赤酵母中外源SOD基因的拷贝数可以相应提高SOD的酶活。     

实时荧光定量PCR法检测转基因猪外源基因整合拷贝数

以GFP转基因猪为研究对象,以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数。同时,利用Southern-blot进行验证分析。结果显示:实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern-blot检测一致。结果表明:实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。     

九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究

以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上     

浙江省4个地区克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的检测分析

随着市场需求的日益增大,克氏原螯虾的养殖规模不断扩大,但克氏原螯虾养殖业却深受白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的威胁。本次研究主要调查浙江省4个地区克氏原螯虾的WSSV携带情况和WSSV阳性感染率与季节温度变化的相关性。本研究检测了4—8月浙江省4个地区螯虾WSSV阳性感染率和阳性螯虾的血淋巴、鳃、肠的病毒拷贝数。综合4个地区每月实验数据,发现在2026 ℃时,4个地区的螯虾WSSV阳性率都可达60%以上,4—6月为WSSV发病的高危时期,到8月随着水温超过26 ℃螯虾WSSV阳性率显著下降。检测发现在鳌虾的血淋巴、鳃、肠中病毒最低的拷贝数为10³,最高的拷贝数为10¹⁰,这说明病毒会长期潜伏感染,等待温度及其他条件合适时再大量复制。本研究将为在克氏原螯虾养殖过程中防治WSSV提供科学依据。     

转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法,本试验通过实时Real-time PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝,为建立快速、有效的品系特异性检测方法奠定基础.同时,在原有构建的含4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子载体上又增加了转OsDREB3基因大豆品系特异性序列,新构建了含有5种转基因大豆品系特异性序列的标准分子及大豆内参照基因(lectin),已完全满足对现有国内覆盖面最大的5种转基因大豆同时、快速筛查检测工作的需要.     

马铃薯T-DNA插入拷贝数的检测及对农艺性状的影响研究

以转基因马铃薯株系为材料,采用Real-time PCR方法,以SYBR Green I为荧光染料,以马铃薯块茎贮藏蛋白基因(Patatin)作为内参基因,以植物表达载体上的潮霉素抗性基因(HPT)为筛选标记基因,建立目的基因CT值与起始模版的相关性标准曲线,通过实时荧光定量PCR分别获得每个样品中内参基因和外源基因的CT值,根据Pfaffl法计算获得了T-DNA在转基因马铃薯中的拷贝数,且与Southern blot方法进行了比较,并结合田间农艺性状,分析了外源基因拷贝数马铃薯株高及薯块产量的影响。结果表明,内参基因和外源基因标准曲线的相关系数分别为R2=0.996、R2=0.995和R2=0.990。在所测的23株转基因株系中,12株为单拷贝插入,6株为双拷贝,5株为多拷贝。Real-time PCR比Southern blot方法结果更准确、操作更简便快捷、成本更低。且插入拷贝数的多少与马铃薯田间农艺性状变化有一定的关系,发现2拷贝以上的T-DNA插入较容易引起部分性状的改变。