转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

拷贝数变异在家禽育种中的研究进展

拷贝数变异（copy number variation，CNV）是广泛存在于畜禽基因组中的一类重要的遗传变异，通常以大片段的DNA序列缺失或重复形式出现，直接影响着基因表达和功能。CNV与许多遗传疾病和表型性状密切相关，因此引起了广大动物遗传育种工作者的密切关注。本文综述了CNV的形成原因、作用机制、检测方法以及现阶段国内外对家禽CNV的研究进展，并讨论了当前CNV研究工作中存在的问题和困难，旨在为实现CNV作为家禽育种中的分子遗传标记进行辅助育种提供参考。     

贵州从江香猪基因组中CNVR36的多态性与产仔数和体尺相关分析

为了研究拷贝数变异与香猪生长及产仔数之间的关系,采用荧光定量PCR方法,测定香猪高、低产群体基因组中CNVR36的拷贝数变化,并与柯乐猪、荣昌猪、大白猪和糯谷猪4个猪品种相比较,进而分析拷贝数变异与香猪生长及产仔数性状之间的关系。结果显示,从香猪基因组中检测到CNVR36的拷贝数存在多态性变化:高产群体中以拷贝数增加为主,低产群体中以拷贝数缺失为主,经卡方检验,两个群体间的拷贝数变异频率差异极显著(P0.01)。柯乐猪、荣昌猪、大白猪和糯谷猪4个猪品种的CNVR36拷贝数以增加为主,相关性分析结果表明,香猪CNVR36拷贝数与胸围之间存在弱的负相关关系,糯谷猪CNVR36的拷贝数与其体宽和胸围有一定的相关关系,荣昌猪的CNVR36拷贝数与体高有一定的负相关关系。推测香猪CNVR36的拷贝数变异可能与生长发育有一定的联系。     

SYBR Green实时定量PCR检测转Fat-1基因水牛体细胞方法的建立

荧光定量PCR是近些年发展起来的一项新技术,可用于检测外源基因的整合拷贝数、临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域,具有广阔的应用前景。本文构建了携带Fat-1基因的标准品质粒,以SYBR Green为荧光染料,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线,并结合绝对定量法检测Fat-1基因在水牛耳缘和肾脏成纤维细胞基因组中的整合拷贝数。结果表明,转Fat-1基因的水牛体细胞的Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.43x+31.01,R2为0.998 7,反应效率为99.5%,具有良好的重复性。本文建立的这种高效检测水牛体细胞基因组中外源基因拷贝数的方法,为后期转Fat-1基因水牛的表达分析和检测等研究奠定基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒人工感染荣昌猪的试验研究

为了评价中国地方猪种对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的易感性,使用1×106TCID50/m L的SCwhn09CD毒株人工感染中国地方品种荣昌猪,记录荣昌猪在试验期间的临床症状、体温变化、体重和死亡率。采用q PCR方法检测感染后第4、7、11和14天血清中的病毒拷贝数。病理切片观察感染后第14天肺部组织的损伤情况。结果显示:感染后荣昌猪表现为精神沉郁、饮食废绝、腹式呼吸、末梢皮肤发绀、持续高温、死亡、鼻腔内有黏性液体等典型猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)症状。感染后第3天直肠温度上升至40℃并一直持续到第14天,并在第12天达到峰值41.2℃。试验期间荣昌猪死亡率达66.7%。第4天血清中的病毒拷贝数达到峰值1.63×106拷贝/m L,随后缓慢下降至4.12×105拷贝/m L,但第4、7、11、14天间血清中的病毒拷贝数不存在显著性差异(P0.05)。肺部组织出现了严重的支气管肺炎病变,肺泡壁显著增厚,致多数肺泡腔闭锁。     

蓝耳病阴性猪PRRSV攻毒试验结果及在血清驯化中的应用

良圻原种猪场2009年在后备猪采用血清驯化,以保持猪群蓝耳病的稳定。为进一步了解公司内部所用猪蓝耳病病毒的特性,用同一猪蓝耳病病毒的不同拷贝数(0、20、40、400、4 000和20 000)分别对6头蓝耳病抗原抗体双阴性仔猪进行攻毒试验。病原检测:攻毒24h后,除阴性猪外,5头猪均抗原检测到PRRSV病毒核酸,抗体检测;攻毒后的前6 d抗体均为阴性,7 d后攻毒猪只抗体逐渐转阳;第9天抗体全部转阳且较第7天有大幅升高第11天后,整体抗体稍有上升但较缓慢,攻毒21 d后,各猪只抗体值在1.7~2.3之间。表明20个病毒拷贝数就足以感染猪只。     

鸡1号染色体114701476-115068911区域与生长性状的关联分析

拷贝数变异（CNVs）作为遗传变异的重要来源,在表型变异和进化过程中起着重要的作用。本试验以华南农业大学杏花×隐性白洛克全同胞资源家系为材料,利用SNP Beadchip芯片的基因分型结果分析1号染色体114701476-115068911区域对鸡生长性状的影响。结果显示,此区域内部GGaluGA038110与GGaluGA038117这2位点处于强烈的连锁不平衡,GGaluGA038239与单胺氧化酶A基因内部GGaluGA038203也存在连锁不平衡关系,且GGaluGA038239、GGaluGA038110与GGaluGA038117这3个SNP位点与鸡生长性状显著相关,表明1号染色体114701476-115068911区域在鸡的生长过程中起着重要的作用。     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建

丹参是著名的传统中药,对心血管疾病和癌症有广泛的疗效。钙调蛋白是细胞信号转导途径中的重要蛋白,在各种生理活动中起着重要的作用,其序列比较保守。国内外对中药丹参的分子学研究很少,本文利用分子生物学手段克隆了丹参钙调蛋白基因。从丹参成熟叶片中提取总RNA,cDNA第一链经反转录合成,利用设计的引物,PCR扩增,得到丹参钙调蛋白基因,测定其全序列。在GeneBank进行了注册。其次构建了丹参钙调蛋白基因反义表达载体,以后可进行基因敲除。通过Southern杂交,进行拷贝数推测,丹参钙调蛋白cDNA至少为2个拷贝。序列分析结果表明:得到的丹参钙调蛋白基因具有完整地读码框,由454个核苷酸组成,编码150个氨基酸。与别的植物钙调蛋白基因相比有很高的同源性,核苷酸序列同源性在80%以上,编码的氨基酸序列同源性在80%以上。以上结果能使我们更加深入地研究和了解钙调蛋白。     

郏县红牛FGF13基因拷贝数变异及其与生长性状关联性分析

本研究旨在检测郏县红牛成纤维生长因子13（fibroblast growth factor 13, FGF13）基因的拷贝数变异（copy number variation, CNV）及其与生长性状之间的相关性分析。本研究利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术,以57头郏县红牛为研究对象,检测FGF13基因CNV,并利用皮尔逊相关分析进行FGF13基因拷贝数与郏县红牛生长性状的关联分析。结果表明,郏县红牛FGF13基因的相对拷贝数高于对照组秦川牛（P<0.05）,在郏县红牛群体中,FGF13基因CNV位点存在拷贝数增加Gain,拷贝数正常Normal和拷贝数减少Loss三种类型;关联分析结果显示,FGF13基因的相对拷贝数与郏县红牛的体斜长呈显著的正相关（P<0.05）。该研究结果表明,FGF13基因的CNV位点与郏县红牛的生长性状显著相关,可作为分子标记应用于郏县红牛的分子标记辅助选择育种工作中。