抗菌肽B、D双基因表达载体的构建及转化广藿香的研究

将人工合成的柞蚕抗菌肽D基因和天蚕抗菌肽B基因分别接上启动子和终止于，克隆到双元表达载体PBin19上，构建成双价抗菌肽基因表达载体pTBD。用三亲交配的方法将pTBD导入根癌农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌将抗菌肽B、D基因导入广藿香，获27个转基因植株。Southern杂交结果表明，抗菌肽B、D基因已同时整合进3个株系染色体组中。与病原细菌Pseudomonassolanacearum试管共培养结果表明，转基因植株获得较强抗病性。盆栽接菌试验结果也表明．转基因植株具有较强抗病性。     

正交设计优化广藿香基因组SRAP扩增体系的研究

以改良CTAB法提取的广藿香叶片DNA为模板,采用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4因素3水平,对SRAP扩增效果进行研究,比较不同模板DNA浓度对PCR扩增的影响,确立适合广藿香SRAP-PCR反应的最佳体系.利用SRAP-PCR优化体系对引物进行了全面筛选.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响,总体积20μL的SRAP-PCR优化反应体系中含有:2 μL 10×buffer、20 ng模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTP、0.3 μmol/L Primer、Taq DNA聚合酶1.5 U.运用该体系对部分广藿香单株进行检验,证明该体系稳定可靠;以此体系为基础从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物18对.     

基于灰色关联分析法评价广藿香药材质量

[目的]建立灰色关联度模型,评价不同产地广藿香药材的质量。[方法]以20个不同产地广藿香药材为研究对象,测定百秋李醇、广藿香酮、挥发油、浸出物、总灰分含量,结合灰色关联度分析法构建广藿香药材质量的灰色关联度评价模型。[结果]20个产地广藿香样品的相对关联度为0.318 8～0.616 9,其中10个产地样品的相对关联度>0.50,其他产地样品的相对关联度<0.50。肇庆高要、雷州英利、阳春潭水产地广藿香样品的相对关联度排名靠前,药材质量优,海南万宁、琼海产地广藿香样品的相对关联度排名靠后,药材质量差。[结论]灰色关联度分析法及模型可用于广藿香药材的质量评价,该研究结果可为广藿香资源的开发与利用提供参考依据。     

广藿香醇合酶 PcPTS 互作蛋白的筛选与鉴定分析

【目的】广藿香〔Pogostemon cablin（Blanco）Benth.〕是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶（Patchouli alcohol synthase,PcPTS）在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白互作层面调控广藿香醇合成的机制尚不清楚。旨在筛选 PcPTS 的互作蛋白,以揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的调控机制和功能。【方法】利用酵母双杂交技术和 GST pull-down 联合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术筛选可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用 MASCOT 软件和 BLAST 分析注释互作蛋白,选取有文献报道参与其他蛋白互作、影响蛋白转运、修饰或降解、参与次生代谢调控的蛋白,利用酵母双杂交技术初步验证它们与 PcPTS 蛋白的互作关系并对互作蛋白进行生物信息学分析。【结果】通过 PCR 技术成功克隆了 PcPTS 的 cDNA 序列,开放阅读框（ORF）为 1 659 bp,编码 522 个氨基酸。构建了广藿香 cDNA 初级文库和酵母杂交文库,初级和次级文库容量分别为 7.6×106 CFU 和 8.6×106 CFU,初级和次级文库的重组率均为 100%,且插入片段平均长度均大于 800 bp。构建的诱饵载体 pGBKT7-PcPTS 对酵母菌株不产生毒性,且无自激活活性。利用酵母双杂交筛选得到阳性克隆并进行测序和 BLAST 分析,获得 17 个候选蛋白。成功构建了 GST-PcPTS 表达载体,诱导表达纯化获得 GST-PcPTS 诱饵蛋白,利用诱饵蛋白从广藿香总蛋白中捕获互作蛋白,共鉴定出 98 个候选互作蛋白。从候选蛋白中筛选 14 个可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用酵母双杂交进行点对点验证,结果发现PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD 与 PcPTS 存在相互作用。生物信息分析表明,四者分别属于 CCCH 锌指蛋白家族、烯醇化酶蛋白、ACR 亚家族和 HAD-like 超家族。【结论】初步筛选验证获得与 PcPTS 存在相互作用的 4个蛋白 PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD,有助于揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的作用机制,也为进一步研究广藿香醇的合成调控机制奠定了坚实基础。     

EM菌对连作广藿香扦插苗生长特性及土壤微生态的影响

【目的】为了缓解广藿香Pogostemon cablin连作引起的减产减质的情况,探究EM菌在广藿香连作中的应用潜力。【方法】设计5个处理组(EM菌以体积分数计):园土(对照土)、重茬土、重茬土+0.1%EM菌活性液、重茬土+0.8%EM菌活性液以及重茬土+1.6%EM菌活性液,并采用盆栽试验探究重茬土中添加EM菌对广藿香扦插苗生长特性以及根际微生态的影响。【结果】在培养基质中添加EM菌活性液的处理组较单一重茬土的根长、株高、鲜质量、根系活力以及叶绿素含量均显著升高,且土壤细菌和放线菌数量增加,土壤真菌数量减少,土壤脲酶、蔗糖酶以及多酚氧化酶活性均显著提高。其中,0.8%EM菌活性液对广藿香扦插苗的生长特性以及根际微生态的影响最显著,株高、鲜质量、根长、根系活力及总叶绿素含量较重茬土分别升高70.34%、195.32%、101.52%、156.84%和195.33%;0.8%EM处理的土壤细菌和放线菌数量在培育第40天达到高峰,土壤脲酶、蔗糖酶和多酚氧化酶活性在培育第40天达到峰值,较重茬土分别升高81.46%、54.26%和137.90%。【结论】在广藿香连作地块添加EM菌能够有效缓解连作障碍问题,可作为广藿香连作栽培中良好添加物。     

广藿香AFLP反应体系的优化及引物筛选

以广藿香叶子为试材,采用AFLP分子标记方法,研究了广藿香AFLP反应体系,包括酶切连接体系、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等关键因素,并对AFLP引物组合(E/M组合)进行筛选,以期为后续的广藿香优良种质资源筛选奠定基础。结果表明:酶切体系为20μL,含300 ng模板DNA,在37℃下反应3 h;连接反应在16℃下反应12 h;连接产物的最适稀释倍数为3倍;预扩增产物的最适稀释倍数为20倍。采用优化好的反应体系筛选出了12对条带清晰、多态性丰富的引物组合。优化好的反应体系适用于广藿香AFLP分子标记研究,筛选出的引物也具有较好的多态性,可为后续的广藿香优良种质筛选提供技术支持。     

苗圃广藿香青枯病药剂防治试验

用可杀得2000对苗圃广藿香青枯病进行防治试验。试验药剂浓度每L为3g、4g、5g,结果表明,试验浓度为5g/L、5mL/株组的,30d存活率为79.42%,空白对照组30d存活率为2.8%。说明"可杀得2000"对广藿香青枯病的治疗效果显著,1～2级病株治疗效果较好,但5级病株治疗效果不好。     

广藿香抗青枯病鉴定技术规范

广藿香是唇形科植物Pogostemon cablin（Blance）Benth.,以叶、梗入药,味辛,性微温。芳香化湿,和胃止吐,祛暑解表。主治湿阻中焦之脘腹痞闷,食欲不振,呕吐,泄泻,外感暑湿之寒热头痛,湿温初期的发热身困,胸闷恶心,鼻渊,手足癣。广藿香原产于菲律宾、马来西亚等国,宋代引入我国,是我国重要的南药之一。广藿香分为石牌香、高要香、湛江香和海南香。广藿香在海南省万宁市有悠久的种植历史,但广藿香青枯病,能造成广藿香大量死株,威胁到广藿香产业的生存和发展。     

HPLC法测定广藿香中齐墩果酸和熊果酸的含量

采用超声技术提取广藿香中齐墩果酸和熊果酸,以薄层层析色谱法对齐墩果酸和熊果酸进行定性分析,以高效液相色谱法进行定量分析,液相条件为:色谱柱为C18柱(250 min×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-0.3%H3PO4水溶液(60:30:10,V/V),流速0.8 mL/min,检测波长210 nm,柱温28...     

广藿香中挥发油的提取及β-环糊精的包合研究

应用水蒸气蒸馏法提取广藿香中挥发油,然后采用正交试验法,以β-CD和广藿香挥发油投料比、包合时间、包合温度为影响因素,以包合物收得率和挥发油包合率的综合评分为指标,选择广藿香挥发油的最佳提取条件及其β-环糊精(β-CD)包合工艺。结果表明,最佳工艺条件为挥发油与β-环糊精之比为1∶8,搅拌强度为600rpm,包含温度为50℃,包合时间为1h。