急性热应激对小鼠肺组织中热应激蛋白和细胞因子基因表达的影响

为研究小鼠在急性热应激条件下肺组织中几种热应激蛋白(heat shock proteins,HSPs)及一些细胞因子基因表达水平的变化情况,通过实时荧光定量PCR的方法检测小鼠急性热应激前后肺组织中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110及白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、β干扰素(IFN-β)及γ干扰素(IFN-γ)的mRNA水平变化情况。结果显示,所有检测的热应激蛋白和细胞因子在热应激后0 h至2h过程中均极显著升高(P0.01),到4 h时恢复到正常水平。此试验结果为揭示急性热应激提高机体的抗病能力提供有价值的资料。     

浙东白鹅催乳素受体基因的克隆及其表达特点的研究

本研究克隆了浙东白鹅催乳素受体基因（PRLR）的部分序列,并应用荧光定量PCR技术研究了浙东白鹅在产蛋期、就巢期和恢复期时PRLR基因在下丘脑、垂体和卵巢中的表达特点,结果表明,浙东白鹅PRLR基因的表达量在产蛋期、就巢期和恢复期差异显著（P〈0.05）,就巢期表达量最高,产蛋期次之,恢复期表达量最低。对不同组织PRLR的表达量分析,垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,垂体与卵巢中的表达量、卵巢与下丘脑的表达量均有极显著的差异（P〈0.01）,垂体与下丘脑中的表达量差异不显著（P〉0.05）。     

SYBR GreenI定量RT—PCR快速检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

针对H5亚型禽流感H基因保守序列设计引物,建立基于sYBRGreenI检测模式的荧光定量RT—PCR（real—timeRT—PCR,RRT—PCR）,最低检测限为2．1×10^2拷贝质粒DNA,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm=（79．5±0．3）℃,对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其它家禽常见病原RNA无扩增,可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2．99％和5．12％;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需5h。     

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR 快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒(BRV)结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、猪瘟病毒(CSFV)、牛结核杆菌(MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)不发生交叉反应;所制作的标准曲线在10²~10⁹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。     

猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其分子流行病学

对已发表的戊型肝炎病毒(HEV)不同基因型毒株全序列进行分析,针对ORF3的保守区设计引物和探针优化建立了HEV荧光RT-PCR检测体系。分析表明该反应体系具有良好的扩增效率、特异性和稳定性,且检测灵敏度比普通RT-PCR方法高10～100倍。利用所建立的荧光定量PCR方法对采集自浙江及其周边上海、江苏等地区规模化猪场的样品以及HEV抗体阳性人血清样品进行了HEV核酸检测。其中,77份人血清样本仅有2份为HEV核酸阳性(2.6%)。而猪粪便样品阳性率则高达20.5%(56/273),且所调查的猪场均存在HEV感染。进一步的分子流行特征分析表明,浙江及周边地区的猪HEV毒株多为基因Ⅳ型,与其他地区的Ⅳ型HEV毒株同源性较高(83.4%～89.5%),但它们之间也存在较多的变异位点。猪源HEV毒株PJ-1则与多数Ⅲ型HEV毒株同源性较高(88%),进化分析也表明其为基因Ⅲ型。人血清样品中检测到的2份HEV毒株Human-1与Human-2与本地区Ⅳ型猪源毒株在分子进化关系上具有很高的亲源性,它们分布于同一分支内,而不构成独立分支。以上分析结果表明浙江及其周边地区猪HEV感染较为广泛,且以基因Ⅳ型毒株为主,但也存在...     

一超“猪无名高热综合征”的诊断与防治

菏泽某猪场出现了一种以无名高热为主要特征的猪病,对发病猪场进行实地走访并采集典型发病猪病料。采用染色镜检和细菌培养等方法鉴定,结果从发病猪体内分离到大肠杆菌,药敏试验表明该菌株对氟苯尼考、头孢呋肟、先锋噻肟、氨苄西林钠高敏,对阿米卡星、庆大霉素、四环素中敏,而对链霉素、妥布霉素、复方新诺明不敏感;通过对病猪料进行实时荧光PCR检测,结果显示猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为阳性,表明该猪场暴发的无名高热综合征是由猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒及大肠杆菌混合感染引起。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

禽源大肠杆菌荧光定量PCR方法的构建及应用

为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×10²～4.69×10⁹copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R²=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×10²copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。     

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSVNsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×10⁴~1×10⁸拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36 h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。     

网状内皮组织增生病病毒特异性杂交瘤细胞培养液中单克隆抗体的效价动态

为获取网状内皮组织增生病病毒(REV)单克隆抗体的最高抗体滴度,在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养对REV特异性的杂交瘤细胞株11B154。每1 mL培养液中平均含0.65×106 个活细胞,于37 ℃在含7% CO2的培养箱中继续培养。在24、48、72和96 h后,每1 mL培养液中的平均总细胞数和活细胞数分别是:1.13×106和1.03×106 (活细胞占94.5%)、3.42×106和2.48×106(活细胞占72.5%)、2.6×106和0.98×106 (活细胞占37.7%)、2.47×106和0.53×106(活细胞占21.5%)。同时用细胞培养上清液对REV感染的鸡胚成纤维细胞作间接荧光抗体试验,在培养24、48、72和96 h后上清液中平均抗体效价分别是1:67、1:133、1:67及1:33。结果表明,培养48 h后,当细胞总数及活细胞总数最高但活细胞百分比开始下降时的培养液中抗体效价最高。该研究结果可作为用细胞培养方法大批量生产抗REV单抗的技术参数。