猪整合素β1蛋白的表达及多克隆抗体的制备

为了制备出猪整合素β1多克隆抗体,根据其氨基酸序列进行生物信息学分析,选取猪整合素β1胞外域具有良好抗原性的位置,根据大肠杆菌偏嗜密码子优化并合成猪整合素β1的重组质粒.接着,使用大肠杆菌原核表达系统进行表达,将纯化的重组蛋白免疫实验兔.通过间接ELISA法检测制备多克隆抗体效价,蛋白免疫印迹的方法对抗体的反应性进行鉴...     

马属动物cyclinT1基因的扩增与真核表达载体的构建

在幔病毒复制过程中cyclinT1(CycT1)是重要的辅助因子.为了揭示慢病毒的复制机理,试验使用RT-PCR方法扩增马和驴的cyclinT1基因,并进行克隆和序列分析,然后用DNASTAR(MegAlign)软件将测得的序列和国外发表的马属动物CycT1序列(GenBank中登录号为AF137509和AF190905)进行同源性比较.结果表明:马属动物CycT1大小为2 184 bp,编码727个氨基酸;4种CycT1基因氨基酸同源性在98%以上;将扩增出的马CycT1基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切及测序鉴定证实成功构建了pcDNA3.1(+)/eCycT1重组质粒.     

表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中，利用Lipofectamine^TM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞，直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察，在3种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多，总的来看，在PK 15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后，都可以观察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测，PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达，单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。     

北极狐多巴胺受体D1基因的克隆测序

为了获得北极狐多巴胺受体D1基因序列,给北极狐自咬行为提供理论依据。采用聚合酶链式反应方法,从北极狐耳组织扩增出多巴胺受体D1基因的部分外显子序列,并对其进行克隆测序,将该序列提交到Genebank上。Genebank中的Blast分析表明,北极狐多巴胺D1受体基因与家狗(Canis familiaris)的同源性为99%,与牛(Bos taurus)的同源性为93%,与人(Homo sapiens)的同源性为92%。     

猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析

为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。     

槟榔江水牛OXCT1基因的分子特征及组织表达谱分析

本研究对槟榔江水牛3-酮酸辅酶A转移酶1（3-oxoacid CoA-transferase 1,OXCT1）基因的完整CDS区进行了PCR扩增,并对其功能生物信息学和多组织差异表达进行了分析。以普通牛OXCT1基因序列（GenBank登录号：XM_006076397）为参考序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,以提取的槟榔江水牛基因组DNA为模板,PCR扩增获得槟榔江水牛OXCT1基因mRNA序列,扩增产物经测序后利用ORF Finder软件进行开放阅读框识别,获得水牛OXCT1基因CDS区全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,槟榔江水牛OXCT1基因CDS序列全长1 563 bp,编码520个氨基酸,蛋白分子式为C₂₅₀₉H₄₀₄₁N₆₈₇O₇₄₆S₂₃,分子质量为56.50 ku,理论等电点（pI）为8.69,不稳定系数为27.49,平均疏水性（GRAVY）为-0.097,该蛋白属弱亲水性蛋白。OXCT1蛋白无信号肽和跨膜结构,属于线粒体膜蛋白;包含pcaJ_scoB_fam和AtoD 2个保守结构域,且具有5个功能活性位点。槟榔江水牛与普通牛、藏羚羊等5个物种的OXCT1氨基酸序列同源性≥ 97%。对槟榔江水牛13个组织进行表达谱分析表明,在泌乳期,OXCT1基因在乳腺中表达量最高,在肾脏、垂体、脂肪、大脑、皮肤和肌肉中不表达;在非泌乳期,OXCT1基因在除脂肪以外的其他12个组织中都有表达。OXCT1基因在槟榔江水牛泌乳期乳腺组织中表达量最高,推测其可能参与了水牛的乳脂合成调控事件。本研究结果可为深入了解乳脂合成代谢及其调控机制提供依据。     

猪腺病毒3型Hexon蛋白多克隆抗体制备与免疫活性鉴定

本研究旨在制备猪腺病毒3型(PADV-3)Hexon蛋白多克隆抗体.试验构建重组原核表达载体pET28a-Hexon,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行Western blotting鉴定,目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫家兔制备Hexon蛋白多克隆抗体.采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度.结果显示,Hexon蛋白原核表达以包涵体形式存在,分子质量约为105 ku;真核细胞表达的Hexon蛋白均定位于HEK293细胞质内,细胞核内无分布;IPMA测定所制备的多克隆抗体滴度为1:1 600,该抗体与体外培养的PADV-3及稳定表达Hexon蛋白的细胞均呈特异性反应.结果表明本试验制备的PADV-3型Hexon蛋白多克隆抗体免疫活性和特异性良好.     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

显微操作针的制作

显微操作技术如今已广泛应用于胚胎生物工程,如体细胞核移植、显微受精、胚胎性别鉴定和胚胎分割等。完成这些工作,首先必须有符合要求的显微操作针,由国外购买成品针用于显微操作人员培训其成本太高。本实验室主要从事牛、羊的体细胞克隆工作,所以由国外购买了拉针仪、煅针仪和磨针仪。经过一年的学习摸索,显微操作针的制作已很熟练,而国内做显微操作针的相关资料还很少,现将实验中摸索出来的一些方法和技巧总结出来与同行共享。1做针用材料实验室购买的是NIKON和LEICA公司的显微操作系统,因此使用的是与其相匹配的外径为1mm,壁厚0.1mm…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10基因的克隆及序列分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒 BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较.结果表明:贵州JL株Nsp10基因的cDNA长699 bp,可编码233 个氨基酸;贵州JL株Nsp10基因与早期分离毒株MLV株、BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株、CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为 91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%～98.7%;而与最近分离毒株HN2007株、SX2007株、GD2007株、YN2008株、GS2008株、XL2008株、TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为 98.3%～98.6%,氨基酸同源性为 99.6%～100%.