猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

瓠瓜KNOX基因家族全基因组鉴定及组织表达分析

【目的】 探明瓠瓜KNOX基因家族特征,在瓠瓜全基因组水平上对KNOX基因家族成员进行鉴定和分析,研究其组织表达模式。【方法】利用生物信息学方法,对瓠瓜KNOX家族基因成员进行鉴定、编码蛋白理化性质分析及家族成员结构域和保守基序分析,利用MEGA 5.05软件构建系统进化树,采用实时荧光定量PCR技术,分析KNOX基因在瓠瓜不同组织（根、茎、叶、花、果实）中的表达情况。【结果】鉴定到12个瓠瓜KNOX家族基因,这些基因分布在6条染色体上,且均定位于细胞核。大多数瓠瓜KNOX家族蛋白含有同源异型盒蛋白特有的4种结构域KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN。系统进化分析将瓠瓜KNOX基因分为KNOX Class Ⅰ和KNOX Class Ⅱ 2大类群,2个类群又可进一步分为5个分支,其中Class Ⅰ-C为瓠瓜特有的进化分支。KNOX基因启动子区有多个激素响应元件和植物生长相关元件。组织表达分析发现,瓠瓜KNOX基因具有不同的表达模式,KNOX Class Ⅰ类基因表达具有组织特异性,在根、茎和果实中表达量较高,在其余组织中表达量较低或不表达,其中Lsi04G014450在根和茎中表达量最高,Lsi11G006380在果实中表达量最高;KNOX Class Ⅱ类基因在所有组织中均有较高表达。【结论】瓠瓜KNOX基因家族有12个成员,分布于6条染色体上,在进化关系上可分为5组,具有瓠瓜特有的进化分支,在不同组织中的表达具有特异性。     

草莓对干旱胁迫生理及分子响应研究进展

干旱胁迫不仅会引起草莓大面积减产,还会直接影响果实的品质,已成为我国栽培品种草莓减产的主要非生物因子之一。本文主要综述干旱胁迫对草莓产量和品质、生理生化特性及部分基因表达的影响;此外,详细介绍了国内外在提高草莓干旱耐受性方面取得的研究进展和成果,以期为研究草莓耐旱机制和选育耐旱性优良的草莓新品种提供一定的参考依据和理论支持。     

静原鸡let-7a-5p的靶基因预测及组织表达分析

【目的】了解let-7a-5p的生物学信息,初步探索其在静原鸡肌肉组织中的功能作用。【方法】利用生物信息学方法对转录组测序获得的静原鸡let-7a-5p的成熟序列进行保守性分析,使用miRDB、TargetScan和miRanda在线软件预测let-7a-5p的靶基因,取其交集进行GO功能和KEGG通路富集分析,并利用实时荧光定量PCR检测let-7a-5p在静原鸡公鸡和母鸡各组织中的表达水平。【结果】let-7a-5p的成熟序列在各物种间高度保守,共预测得到38个基因集合。在生物过程、细胞组分和分子功能中靶基因富集较多的GO条目有细胞过程、生物调节、细胞、结合和催化活性;靶基因显著富集于聚酮糖单元生物合成、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解、TGF-β信号通路和加压素调节的水重吸收信号通路,且富集最多的是代谢途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路。let-7a-5p-靶基因互作主要通过作用于靶mRNA的3′-UTR抑制表达或使其降解。组织表达发现,let-7a-5p在静原鸡公、母鸡的心脏、肝脏、脾脏、...     

高温胁迫下绿豆象内参基因筛选及其Hsp70基因的表达特性

为明确Hsp70蛋白在绿豆象Callosobruchus chinensis高温耐受性中的作用,该研究筛选并克隆β-actin、α-tubulin、β-tubulin、EF1-α、GAPDH、Hsc70、AK和RPL40八个候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术测定其在绿豆象雌雄成虫体内的表达量,通过geNorm、BestKeeperr和NormFinde软件对这8个候选内参基因的表达稳定性进行评价,选择最适宜的内参基因对不同高温胁迫下绿豆象体内Hsp70基因的表达特性进行测定。结果表明,8个候选基因引物均有良好的特异性和引物扩增效率,引物扩增效率介于91.6%～108.1%之间。高温胁迫下,β-tubulin基因较其他7个候选基因有较小的平均变异度、稳定值和标准差,为最适宜的内参基因。39、42和45℃高温处理1 h后绿豆象雌雄成虫体内Hsp70表达水平较对照显著上调,当处理时间延长至3 h后,Hsp70基因的相对表达量较对照也有不同程度上调,但差异不显著,表明绿豆象Hsp70基因可以响应高温胁迫,Hsp70蛋白在绿...     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

辣椒CaCOI1 基因的克隆、表达及其序列分析

 利用RT-PCR技术从辣椒中克隆到基因CaCOI1,该基因编码的蛋白质由603个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为68.35 kD,等电点是6.32。在蛋白质N–端有1个F-box结构域,C–端有6个富含亮氨酸结构域。二级结构分析表明,CaCOI1蛋白分子中,α–螺旋、β–折叠、β–转角和不规则卷曲分别为51.41%、13.76%、5.80%和29.03%。CaCOI1蛋白的平均亲水系数为–0.143,为亲水蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,CaCOI1与番茄LeCOI1蛋白的一致性最高（94%）,进化距离最近。实时定量RT-PCR分析表明,CaCOI1在辣椒的根、茎、幼叶、成熟叶、花、青熟期果实、成熟红果等不同生长发育时期的组织中都能表达,在花中表达水平最高,是其他组织的2.8 ~ 5.4倍,表明CaCOI1在花的发育过程中起重要作用。     

简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原基因的克隆表达及免疫特性分析

为研究简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原的免疫特性,本研究提取了线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增肌钙蛋白类过敏原(Anis1)基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后将anis1基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白。通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,融合蛋白采用Western blotting分析。将纯化的Anis1重组蛋白免疫小鼠,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。酶切和DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组Anis1蛋白,重组蛋白经Western blotting分析证实为目的蛋白,纯化蛋白Anis1免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组蛋白Anis1能被免疫血清识别,说明简单异尖线虫重组蛋白Anis1具有较好的免疫原性和免疫反应性。     

荧光定量PCR技术及其在动物营养中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种通过检测PCR荧光信号的变化进行核酸定量的技术。目前,该技术已经应用于病原微生物、基因表达、基因组变异和多态性检测等许多方面。本文综述了定量PCR技术的基本原理及其在动物营养中的应用。