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【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律,并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间(0-24 h)的牛卵母细胞,用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况,通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因(GenBank登录号:NM_001046332.1)的mRNA序列设计引物,并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点,用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区,将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应,得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后,将Cdc42WT(775 bp)和Cdc42T17N(775 bp)片段分别连接到pcDNA3.1(+)的多克隆位点区域,得到相应的原核表达载体pcDNA3.1(+)-Cdc42WT和pcDNA3.1(+)-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA,用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内,检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异,但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化:Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞中很少出现,而在第一次减数分裂中期(metaphase Ⅰ,MⅠ)卵母细胞中出现得最多也最为明显;Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期(pro-metaphase Ⅰ,pMⅠ),并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期(metaphase Ⅱ,MⅡ)逐渐增多;Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期(anaphase Ⅰ,AⅠ)到末期(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞中占有有很高比例,而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段,构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后,符合预期结果,即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N;③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1(+)-Cdc42WT和pcDNA3.1(+)-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对,符合预期结果,经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段,符合预期结果,即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA;④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比,注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低(P<0.05)。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白,而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用,而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。 相似文献
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无糖组培微环境控制技术高新设备的研制与应用 总被引:3,自引:1,他引:3
无糖组培微环境控制技术已经成为植物组织培养的新领域,受到广泛的关注。目前日本已经开展实验室范围内的大规模植物无糖组培。笔者详细介绍了目前国内最新研制的无糖组培微环境控制技术高新设备的系统构造和性能。通过对该设备的调试和运行,开展了众多植物种苗的无糖组培试验,结果表明在控制光照和CO2浓度等微环境条件下,该设备能有效提高植物组培苗的生物量、根干重、生长率、叶绿素a和可溶性蛋白质,不仅实现植物种苗的快速培养、大量繁殖,而且能够促进植株生根发芽,提高组培种苗移植后的成活率。 相似文献
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目的分析霉菌性副鼻窦炎CT的表现和特征,了解CT诊断对该病的意义。方法对10例经手术及病理证实的霉菌性副鼻窦炎的CT征象作临床回顾性分析。结果霉菌性副鼻窦炎CT主要为单侧或双侧多个鼻窦窦腔内填充软组织密度影,但以上颌窦为主和单侧多见;窦腔密度增高、不均匀、呈絮状,平均CT值为55~70Hu,其腔内可见斑点状、云絮状、条带状高密度钙化影,窦壁多呈反应性增厚。部分病例伴有鼻窦骨质吸收破坏。结论病变内钙化影是霉菌性副鼻窦炎CT的主要表现,是诊断该病较为可靠的依据。 相似文献
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覆盖作物多样性对猕猴桃园土壤微生物群落功能的影响 总被引:3,自引:2,他引:3
以丹江口水源涵养区猕猴桃园为研究对象,运用Biolog微平板技术,研究不同种类覆盖作物处理(2、4、8种和清耕对照)下土壤微生物群落功能多样性的差异。结果表明,覆盖作物处理土壤微生物群落对碳源的利用程度、功能多样性指数和丰富度指数均高于清耕对照。覆盖作物及清耕对照处理土壤微生物Shannon-Wiener多样性指数、丰富度指数与土壤含水量、有机碳、pH、微生物量碳氮呈显著正相关关系。主成分分析与碳代谢图谱分析表明,猕猴桃园增加覆盖作物种类提高了土壤微生物对碳源的利用能力,且对D-甘露醇、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-苯丙氨酸、γ-羟丁酸、α-丁酮酸、4-羟基苯甲酸、吐温40的利用能力显著高于清耕对照。此外,4种覆盖作物处理对猕猴桃园土壤生态环境的影响优于2种和8种。研究表明,猕猴桃园增加覆盖作物多样性改变了土壤环境因子,影响了土壤微生物群落的代谢活性和功能多样性。 相似文献
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The inhibitory effect of the herbicide diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea] on microbial activity in red Latosol soil was followed using microcalorimetry. The activity of the micro-organisms in 1.50 g of soil sample was stimulated by addition of 6.0 mg of glucose and 6.0 mg of ammonium sulfate under 35% controlled humidity at 298.15 (+/- 0.02) K. This activity was determined by power-time curves that were recorded for increasing amounts of diuron, varying from zero to 333.33 micrograms g-1 soil. An increase in the amount of diuron in soil caused a decrease of the original thermal effect, to reach a null value above 333.33 micrograms g-1 of herbicide. The power-time curve showed that the lag-phase period and peak time increased with added herbicide. The decrease of the thermal effect evolved by micro-organisms and the increase of the lag-phase period are associated with the death of microbial populations caused by diuron, which strongly affects soil microbial communities. 相似文献
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