I群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒（FAVI）灭活苗免疫和野毒感染的检测方法,为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI 33K重组蛋白为包被抗原,筛选和优化间接ELISA的条件,建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0 μg/mL,包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶,封闭时间1.0 h;待检血清稀释度1∶100,抗原抗体最佳作用时间1.0 h;酶标二抗最佳稀释度1∶3000,作用时间45 min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明,优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测,可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种,利于挑选出FAVI感染动物,为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。     

检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体间接ELISA的建立

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400、1∶80、1∶40、1∶40,相应粘附素抗体最佳稀释度依次为1∶400、1∶200、1∶200、1∶200。经交叉试验、阻断试验和重复试验证实,本方法具有良好的特异性和重复性。     

酶联免疫吸附法快速检测鳗弧菌

制备了鳗弧菌E3-11菌株的兔抗血清,并应用间接酶联免疫吸附法,建立了一种新的快速诊断鳗弧菌的方法。该方法能检出⒈5×105个·ml-1浓度的E3-11菌株,对患病鱼体的组织培养物鳗弧菌进行检测,呈现明显的阳性反应。对嗜水气单胞菌(A.hydrophila),柱状纤维粘细菌(C.columnaris),非01霍乱弧菌(Non-01)等几种在养殖中主要致病菌不发生交叉反应,同时该反应过程可在较短时间内完成。该方法具有敏感性高、特异性强、速度快、实用方便等特点,可应用于鳗弧菌的快速检测和诊断。     

应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。     

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平。[方法]采用ELISA法对2010~2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒(gE)抗体和免疫(gB)抗体检测。[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5%和28.4%,其中60~100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2%,100~210日龄的总样品阳性率为42.1%;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2%,60~160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50%。[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80~130日龄育肥猪免疫抗体水平较低。     

基于α_s-酪蛋白特异性的牛乳总蛋白质ELISA定量检测方法的建立

本研究旨在建立牛乳中总蛋白质的ELISA定量检测方法,并评价该方法在牛乳掺假辨识中的应用效果。首先用αs-酪蛋白标准品免疫新西兰白兔,制备αs-酪蛋白特异性抗血清,并建立αs-酪蛋白的间接ELISA检测方法,结果显示血清效价为1∶640,αs-酪蛋白检测的线性范围是25~600 ng/ml,R2=0.999 5,回收率是96.6%~105.2%。再应用乳成分分析仪,凯氏定氮法和所建立的ELISA法测定8份来源不同的原料乳中总蛋白和αs-酪蛋白含量,结果显示不同牛乳中总蛋白质含量在0.029 2~0.029 8 g/ml,αs-酪蛋白含量在0.008 4~0.009 2 g/ml,占牛乳总蛋白质的比例恒定,平均为0.3,并用该系数建立牛乳中总蛋白质的定量方法。最后对5份人为兑水稀释、添加尿素、BSA和三聚氰胺的模拟掺杂牛乳样品进行检测,测定结果表明基于αs-酪蛋白的ELISA方法比乳成分分析仪法和凯氏定氮法具有更高的灵敏性和特异性,含氮添加物对测定结果无显著影响(P0.05),更适合于作为原料乳及含乳产品中牛乳蛋白质的定量分析。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明,该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34μg/kg,IC50(50%抑制浓度)为4.8μg/L,回收率为60.5%~79.7%,试剂盒的标准曲线范围为0~80μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10%,三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%,4℃下能够保存12个月,稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

猪流行性腹泻病毒血清IgG间接ELISA检测方法的建立

以大肠杆菌表达系统制备的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原S1D(1μg/mL)每孔100μL进行包被,利用HRP-兔抗猪IgG(1∶20 000)建立了检测猪血清中抗PEDV IgG的间接ELISA方法。阴性判断临界值(M+2SD)为0.632,批内和批间检测的平均变异系数分别为2.3%和3.1%,该方法与商品化的PEDV抗体间接ELISA检测试剂盒同时检测50份临床血清样品,均为阳性,上述结果表明该方法可用于PEDV血清IgG的临床检测。