Prokaryotic Expression and Antigenicity Analysis of Porcine Japenese Encephalitis Virus Envelope Protein Domain Ⅲ

In order to analyze the antigenicity of porcine Japanese encephalitis virus (JEV) E protein domain Ⅲ, which was expressed by pET-28a vector with His-tag and purified through Ni-NTA, the BALB/c mice were immunized with the purified protein.We identified the antigenicity of domain Ⅲ of E protein and the anti-mice and anti-porcine JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by SDS-PAGE, Western blotting, indirect ELISA and IFA.SDS-PAGE results showed the expressed target protein existed mainly in the form of inclusion body.Western blotting, ELISA test results showed that the protein had good reactivity with anti-serum.The mice immunized with the purified JEV E Ⅲ protein generated 1×10⁵ anti-JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by ELISA, and the porcine immunized with the porcine JEV generated 5.1×10⁴ anti-JEV specific antibody titers.The IFA results showed that JEV E Ⅲ protein anti-serum could identify JEV antigen.The above results showed that the recombinant JEV E Ⅲ had good antigenicity.These results provided important basis for development of diagnostic antigen for JEV.     

倍他米松ELISA检测方法的建立

为建立倍他米松(BET)ELISA检测方法,先使BET与琥珀酸酐反应,再采用活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原;其次,利用免疫动物获得多克隆抗体,经Sephrose 4B-proteinA方法对抗体进行纯化;最后,建立倍他米松ELISA检测方法。结果表明,免疫抗原偶联成功,获得了亲和力较高的多克隆抗血清,间接竞争ELISA测定其滴度为102 400、IC15为6.60×10-5 ng/mL和IC50为0.97ng/mL。该方法适用于残留在动物性食品中的BET现场大批量检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800～1∶25 600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47～57 aa、57～67 aa及67～77 aa区域,其中57～67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。     

美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化

对原核中以包涵体形式高效表达的美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段进行了变性、复性与纯化研究。将美洲型PRRSV重组质粒pGEX-6P-1-N转化入E.coliBL21(DE3)细胞中,成功表达了重组蛋白GST-N,超声裂解复性后目的蛋白经GSTrap FF纯化试剂盒纯化后,纯度可达90%以上。将欧洲型PRRSV重组质粒PQE30-N转化入E.coliM15细胞中表达了重组蛋白His-N。超声裂解后目的蛋白经HisTrapHP蛋白纯化试剂盒纯化后,纯度可达95%以上。Western blot结果表明,两种蛋白分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清识别。纯化出的大量美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段,为PRRSV的鉴别诊断提供了抗原基础。     

上海地区多种动物戊型肝炎血清学调查

在上海地区收集血液样品(猪、牛、山羊、马、鸡、鸭、鸽、犬和部分珍禽等)964份,应用双抗原夹心酶联免疫法(DS-ELISA)检测抗HEV抗体。结果表明,猪抗HEV抗体的阳性率为72.18%(301/417),其中母猪阳性率最高,为82.53%(222/269),育成猪阳性率为52.54%(62/118),保育猪阳性率为50.00%(15/30);22个猪场均检测到抗HEV抗体阳性猪,阳性率高于60%的猪场有16个,占阳性猪场的72.72%。在牛、山羊、马、鸡、鸭、鸽等血清中也检测到了抗HEV抗体,阳性率分别为6.00%,24.00%,16.00%,1.90%,12.77%和4.44%,明显低于猪群的阳性率。在宠物犬中检测到了抗体阳性犬,阳性率为17.82%(18/101),说明犬对HEV易感。珍禽中野鸭、火烈鸟对HEV也有一定的敏感性,阳性率分别为6.60%(1/15)和10%(1/10),在孔雀和鸵鸟的血清标本中未检测到HEV抗体。猪群中戊型肝炎病毒存在较普遍,其他与人类密切相关的多种动物也对HEV敏感。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

苯巴比妥(PB)经化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成半抗原对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法将pAPB偶联于BSA,合成人工抗原BSA-pAPB,并用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE鉴定;用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗PB的单克隆抗体mAb(PB mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备PB mAb,并鉴定其免疫学特性。结果表明,BSA-pAPB偶联成功,偶联率为1∶19;筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株杂交瘤细胞,其中最好的4E6株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶8.1×102,腹水为1∶6.4×105,同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.08×1010L/mol,对PB的半数抑制浓度(IC50)为11.35μg/L,与巴比妥的交叉反应率(CR%)为12.4%,与其他化合物无CR。本试验研制出高效价、敏感、特异的PB mAb,可用于PB残留检测的免疫学实验。     

Cloning,Expression and Bioinformatics Analysis of Enterococcus faecalis from Northeast Black Bear

In order to detect Enterococcus faecalis endocarditis antigen (EfaA) of bear that was used to disclose the infected Northeast Black bear immediately, a pair of PCR primers was synthesized by EfaA gene of Enterococcus faecalis that was recorded in GenBank (accession number:U03756.1) and the target fragment was 689 bp. The PCR product was cloned by pMD19-T vector, then was transferred to Escherichia coli DH5α competent cells and the positive clones were filtered. Recombinant plasmid (pMD19-T-EfaA) was extracted. Identification of PCR and digestion, sequencing, the structure prediction of proteins were operated. The results showed that EfaA gene was cloned successfully, and the gene homology with ATCC 29212 was 100.0%. pMD19-T-EfaA was constructed successfully, structure of proteins was predicted. This study provided theoretical basis for diagnostic methods of Enterococcus faecalis and laid basis for prevention and control of Northeast Black bear disease.     

布鲁菌主要免疫抗原研究进展

布鲁菌主要免疫相关抗原有脂多糖、外膜蛋白、菌体蛋白,研究这类抗原是解决目前布病菌疫苗存在保护时间短以及布病血清学诊断无法区分免疫、感染以及毒力返强的重要突破口。生物技术的发展促进了对抗原的结构、抗原表位及其诱导的免疫应答等方面的深入研究,并在此基础上构建了多种重组融合蛋白疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、包含优势表位的多价疫苗;同时免疫相关抗原的研究也为布病诊断试剂的开发奠定了基础并提供了更多选择。     

植物增殖细胞核抗原与DNA复制关系的研究现状

为了更深入的对植物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)进行研究,本研究归纳了PCNA的研究现状,总结了PCNA的结构特征和包括PCNA参与DNA复制、DNA损伤修复和细胞周期调控等在内的PCNA的功能特点。目前有关PCNA的研究以医学和动物体为主,有关植物PCNA研究的报道很少且相对落后,但已有文献指出,PCNA调控DNA复制,参与DNA复制以确保植物体正常生长发育,因此植物PCNA的功能值得继续研究。     

PEDV N蛋白的原核表达纯化及B细胞抗原表位预测分析

本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。