亚洲穿山甲实时荧光PCR鉴定方法的研究

受利益驱使,人类长期大量捕杀穿山甲并走私至中国用作食材和药材,导致穿山甲的数量急剧下降,仅存的4种亚洲穿山甲均被列为极危或濒危野生动物。为切实加强野生动物保护,有效打击走私犯罪活动,本研究基于8种现存穿山甲线粒体Cyt b基因序列设计一组通用型引物、探针,建立亚洲穿山甲的鉴定方法;使用荧光PCR法对现有亚洲穿山甲样本及相关比对样本进行DNA扩增,从特异性、灵敏度、稳定性等方面对建立的方法进行验证和优化。结果表明：所建立的鉴定方法能够准确识别亚洲穿山甲源性成分。     

猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

试验根据猪链球菌2型荚膜多糖（CPS）抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×10¹拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。     

猪捷申病毒TaqMan实时定量RT-PCR方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)的早期检测及定量分析方法,本研究基于PTV 11个血清型基因组5′端非编码区保守序列,设计引物和TaqMan探针,建立了检测PTV的TaqMan实时定量RT-PCR方法.应用该方法对PTV、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒以及猪瘟病毒进行特异性试验,结果除PTV为阳性外其它均为阴性;针对PTV最低可检测到10个拷贝;批内、批间重复试验的变异系数均小于3％.应用建立的方法与病毒分离方法分别对91份临床样品进行检测,检出率分别为79.12％和57.14％,两者的符合率是78.02％.经临床应用表明,该实时定量RT-PCR方法可为PTV的早期诊断及定量分析提供技术手段.     

实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病,尤其是对母猪,该病毒严重影响其繁殖性能。实时荧光定量PCR以其快速、可靠的诊断技术,为检测和诊断PRRSV开辟了新方法。文内对国内外实时荧光定量PCR技术在PRRSV研究中的应用作了综述。     

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),根据PDCoVM基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×10³～1.3×10⁷ copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R²=0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.24%～2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 10⁶ dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method.     

内蒙古草原资源及可持续利用对策

草原资源在气候及人为因素干扰下处于动态变化之中，及时掌握草原资源现状及其变化，对草地合理利用及草原保护建设有着十分重要的意义。自2001～2003年内蒙古草原勘察设计院利用遥感、地理信息系统、全球定位系统，结合地面调查方法，摸清了内蒙古草原资源现状及生产力。目前拥有草原总面积为7491．85万hm^2，其中可利用草原面积6293．13万hm^2。与上世纪80年代相比全区草原面积减少了388．60万hm^2，变化率为-4．93％；与60年代草原面积相比，近40年草原面积减少了1003．43万hm^2，变化率为-11．81％。在摸清草原资源的基础上，建立了草原资源信息数据库，实行动态管理。以此提出了草原资源可持续利用对策，必须坚持“全面规划，依法保护，重点建设，合理利用”的原则，通过重点建设带动全面保护，通过全面保护巩固建设成果，并采用现代化遥感手段进行实时监测，为各级主管部门宏观决策提供科学依据。     

Calpain 1．5 mRNA表达量与鸭肉嫩度关系的研究

选择60只70日龄左右、体重相似高邮鸭、樱桃谷鸭和番鸭,屠宰后取左半膛测定剪切力,用荧光实时定量PCR法,以β-actin基因为内标,检测calpain 1.5基因的表达量与嫩度的关系,并进行品种间比较.通过对3个品种鸭剪切力的测定.高邮鸭>樱桃谷鸭>番鸭,差异均不显著(P>0.05);3个品种都是胸肉<腿肉,即胸肉嫩度大于腿肉,差异显著(P<0.05).说明3个品种鸭肉嫩度由高到低依次为番鸭>樱桃谷鸭>高邮鸭.鸭胸肉与腿肉calpain 1.5基因mRNA表达量差异显著(P<0.05).肉的剪切力和calpain 1.5基因mRNA相对表达量呈对数关系(0.5相似文献   

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(He-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立一种基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法.结果表明,该方法能够检测到HP-RRSV的存在,不与其它猪源病毒发生非特异性反应,标准曲线线性范围为1011拷贝/反应～102拷贝/反应.与常规PCR方法相比,两者的符合率100%.该方法具有快速、简便、敏感等优点,具有重要的实用价值.